Хроматография

Хроматография

Сущность и классификация методов хроматографии

Открытие хроматографии как метода разделения и анализа веществ принадлежит русскому ботанику М. С. Цвету, который в 1903 г. опубликовал работу, посвященную хроматографиче-екому анализу хлорофилла.

Принцип хроматографического метода разделения основан па различии в адсорбционной способности веществ, которая за­висит как от природы адсорбируемых веществ, так и от природы адсорбентов. Это можно представить и таким образом, что при адсорбционном равновесии они не­одинаковое время находятся на поверхности адсорбента. Если смесь газов или жидкий рас­твор пропускать через слой адсорбента — хроматографическую колонку, то из нее раньше будут выходить компоненты, кото­рые сорбируются слабее. В процессе прохождения через слой адсорбента смеси веществ непрерывно совершаются акты ад­сорбции — десорбции, в результате которых сильносорбирую­щиеся вещества (они дольше находятся на поверхности адсор­бента) «отстают» от слабосорбирующихся веществ. Очевидно, что чем толще слой адсорбента, тем эффективнее разделение. Таким образом, хроматография — это метод разделения ком­понентов подвижной фазы (смеси газов, раствора) при движе­нии ее относительно другой неподвижной фазы (слоя сор­бента).

Основным достоинством хроматографии является универ­сальность метода; он пригоден для разделения практически любых веществ. Увеличение толщины слоя адсорбента (высоты хроматографической колонки) позволяет обеспечить высокую степень разделения даже близких по свойствам веществ, ионов. Это значит, что степень разделения можно регулировать. Ме­тод пригоден для работы с макроколичествами и микроколиче­ствами веществ. Хроматографический метод разделения ве­ществ легко поддается автоматизации.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую и жидкостную хроматографию. В газовой хроматографии подвижной фазой является газ. Этот метод хро­матографии служит для разделения летучих веществ, к кото­рым обычно относятся вещества с молекулярной массой при­близительно до 300, и термически стойких соединений. В жид­костной хроматографии подвижной фазой служит жидкость. Она применяется для разделения нелетучих веществ с молеку­лярной массой от ~300 до 1000—2000, неорганических ионов и термически нестойких соединений. Таким образом, газовая и жидкостная хроматография дополняют друг друга.

Неподвижная фаза, применяемая в хроматографировании, может быть твердой и жидкой. В соответствии с этим газовую хроматографию делят на газо-адсорбционную с твердым адсор­бентом в качестве неподвижной фазы и газо-жидкостную, в ко­торой неподвижной фазой служит твердый инертный носитель, поры которого заполняют жидкостью (в ходе хроматографирования происходит абсорбция газа жидкостью). Аналогично жидкостную хроматографию делят на жидкостно-адсорбционную (неподвижная фаза — твердый адсорбент) и жидкостно-жидкостную (обе фазы — жидкие).

В зависимости от механизма процесса сорбции жидкостную хроматографию классифицируют на молекулярно-адсорбцион-лую (реализуется физическая адсорбция), ионообменную (ионообменная адсорбция), распределительную (в основе — различная растворимость разделяемых компонентов в жидко­стях подвижной и неподвижной фазы), осадочную (осадитель в неподвижной фазе с разделенными компонентами образует соединения с различной растворимостью в подвижной фазе), гель-хроматографию (различная проницаемость молекул раз­деляемых веществ в неподвижную фазу геля обусловлена раз­мерами молекул).

По способам оформления метода хроматографию делят на колоночную и плоскостную. Плоскостная в свою очередь вклю­чает бумажную и тонкослойную хроматографию. В бумажной хроматографии в качестве адсорбента используется специаль­ная однородная бумага, на которую наносят раствор разделяе­мых компонентов. Под действием капиллярных сил и диффузии отдельные компоненты движутся по поверхности бумаги с раз­личной скоростью. В тонкослойной хроматографии применяют тонкие слои адсорбента, нанесенные на пластинку из инертного материала.

Рекомендуемые материалы

Наиболее широко используется колоночная хроматография, в процессе которой разделение веществ происходит в узкой и длинной хроматографической колонке, заполненной адсорбен­том.

В зависимости от способа передвижения компонентов сме­си вдоль неподвижной фазы различают три метода: прояви-тельный (элюационный), вытеснительный и фронтальный.

Проявительный (элюционный) метод заключается в том, что смесь веществ сорбируют в верхнем слое неподвижной фа­зы, а затем через нее пропускают элюент — нейтральный раз­бавитель (например, инертный газ) или вещество, сорбирую­щееся хуже разделяемых компонентов. В ходе элюирования компоненты выделяются отдельными зонами, которые изоли­рованы друг от друга чистым элюентом.

Вытеснительный метод отличается от проявительного тем, что в качестве элюента применяют вытеснитель — вещество, сорби­рующееся лучше разделяемых компонентов. При вытеснении разделяемые компоненты смеси выделяются примыкающими друг к другу зонами, выходящими из колонки в порядке увели­чения сорбируемости компонентов.

Представим себе хроматографическую колонку с сечением, равным единице площади, в которой достигается равновесное распределение вещества между подвижной и неподвижной фаза­ми. Составим уравнение материального баланса по распределяющемуся веществу (продольную диффузию в непо­движной фазе не будем принимать во внимание). Обозначим объемную скорость потока подвижной фазы через w, а через Dt — время прохождения участка Dх; тогда за это время прой­дет объем подвижной фазы wDt. При адсорбции концентрация компонента в подвижной фазе уменьшается на Dс, а общее ко­личество вещества, ушедшего из подвижной фазы, равно wDtDс. Если q — количество сорбента, приходящееся на единицу длины колонки, то на участке Dх его количество составит qDх. В ре­зультате адсорбции концентрация вещества в сорбенте возрас­тает на DА, а общее его количество, перешедшее в сорбент на участке Dх, станет равным qDхDA. Запишем уравнение матери­ального баланса:

wDtDс = qDхDA                (III. 162)

Переходя к бесконечно малым величинам и записывая соот­ношение (III. 162) относительно линейной скорости перемещения вещества и вдоль колонки, получим:

                                III. 163

Уравнение (III. 163)   является   основным   уравнением   идеальной равновесной хроматографии.

Основными хроматографическими характеристиками, с по­мощью которых можно сделать заключение о качестве разделе­ния компонентов смеси, являются время удерживания т_уд и объем удерживания V_уд. Время удерживания — вре­мя от момента ввода пробы до момента регистрации максимума пика на хроматограмме. Объем удержива­ния — объем элюента (га­за-носителя), прошедший через хроматографическую

Время удерживания можно выразить как отноше­ние длины колонки L к линейной скорости движения вещества u:

t_уД = L/u                 (111.166)

Эффективность разделения b определяется отношением рас­стояния между максимумами хроматографических пиков к сум­ме ширин пиков

b=Dl/(m₁+m₂)

Кроме колоночной хроматографии, широко используемой в разнообразных вариантах, получила распространение и плос­костная хроматография, особенно ее разновидность — бумажная хроматография. Она выполняется на специальной хроматогра-фической бумаге, обладающей изотропностью по всем направле­ниям, равномерной плотностью и толщиной. Ко­личественная оценка процесса ведется с помощью коэффициента R_f равного отношению скорости движения вещества к скорости движения элюента (растворителя). Коэффициент разделения равен отношению этих коэффициентов для двух веществ и про­порционален обратному отношению коэффициентов распределе­ния (III.164):

b_1/2 = R_{f 1} / R_{f 2}             III.171

Подобным образом проводится количественная оценка эф­фективности разделения компонентов смесей в тонкослойной хроматографии, которая отличается от хроматографии на бума­ге тем, что выполняется на тонких слоях различных адсорбен­тов, наносимых обычно на стеклянные пластинки. Из уравнения (III. 163) следует, что линейная скорость передвижения вещества в общем случае зависит от вида изотермы адсорбции, т.е. от производной dA/dc. Таким образом, скорость движения вещества не зависит от его концентрации. Форма хроматографической зоны на хромато-грамме также не меняется в ходе перемещения вещества, так как элементы объема с любой концентрацией вещества передвига­ются с одинаковой скоростью. Если бы отсутствовала продоль­ная диффузия, концентрация вещества вдоль потока не меня­лась бы и форма хроматографической зоны напоминала вид, показанный на рис. II 1.296 (кривая 1). Однако в реальных ус­ловиях имеет место продольная диффузия, и вследствие этого распределение концентрации вещества вдоль потока несколько изменяется, соответственно размывается и хроматографическая зона. Ее форма напоминает кривую распределения Гаусса.

С увеличением концентрации перестает соблюдаться закон Генри. Если изотерма имеет вид выпуклой кривой (кривая 3 на рис. III.296), то производная dA/dc уменьшается с увеличе­нием концентрации, а скорость движения вещества возрастает. В результате наблюдается преимущественное размывание (кри­вая 3 на рис. III.296) задней части зоны (тыла зоны), которая движется медленнее, так как концентрация в ней меньше (вследствие диффузии). При вогнутой изотерме сорбции  производная dA/dc увеличивается с ростом концентрации и соответственно скорость движения вещества уменьшается. Это приводит к преимущественному размыванию передней части зоны (ее фронта), чему способствует возраста­ние скорости движения вещества при уменьшении концентрации.

Так как при нелинейных изотермах сорбции происходит раз­мывание хроматографических зон, что ухудшает качество разделения, то, очевидно, для лучшего разделения необходимо стремиться проводить исследования в области концентрации, при которых соблюдается закон Генри.

Основные характеристики хроматографического разделения

Хроматограмма, регистрируемая самописцем хроматографа, от­ражает зависимость сигнала детектора от времени пропускания элюента или от его объема. На рис. III.30 показаны зависимо­сти сигналов дифференциального и интегрального детекторов, т.е. дифференциальная и интегральная хроматограммы. Ли­ния 1 хроматограммы (нулевая линия) отвечает выходу из ко­лонки чистого газа-носителя (в газовой хроматографии). Пик2 указывает на присутствие в пробе слабосорбирующейся приме­си. Пики 3 и 4 соответствуют компонентам анализируемой сме­си. Пик ограничен фронтом и тылом. По линии фронта наблю­дается возрастание концентрации вещества со временем до мак­симального значения, а по линии тыла она со временем уменьшается.

Основными параметрами хроматографического пика являют­ся его высота и ширина. За высоту пика h принимают расстоя­ние от нулевой линии до максимума пика (или до точки пересе­чения касательных к линиям тыла и фронта пика. Ширина пика i определяется как расстояние между тылом и фронтом на половине его высоты (иногда указывают ширину пика на высоте, например 0,75/г, 0,9/г). Отношение ширины к высоте пи­ка характеризует степень его размывания. По ширине и высоте пика рассчитывают количество вещества, прошедшее через хроматографическую колонку.

Основными хроматографическими характеристиками, с по­мощью которых можно сделать заключение о качестве разделе­ния компонентов смеси, являются время удерживания т_уд и объем удерживания V_уд. Время удерживания — вре­мя от момента ввода пробы до момента регистрации максимума пика на хроматограмме. Объем удержива­ния — объем элюента (га­за-носителя), прошедший через хроматографическую. Время удерживания можно выразить как отноше­ние длины колонки L к линейной скорости движения вещества:

В лекции "22.2 Реформа политической системы и борьба общественно-политических сил" также много полезной информации.

Ту_Д = 1/и               

Для двух разделяемых компонентов 1 и 2 количественными характеристиками разделения могут служить отношение времен удерживания или их разность. Таким образом, отношение времен удер­живания определяет константу разделения, а разность времен удерживания характеризует степень разделения с учетом мно­гократных актов сорбции-десорбции вдоль неподвижной фазы, Чем больше длина колонки L, тем дальше друг от друга нахо­дятся зоны компонентов, т. е. тем лучше их разделение. Эффективность разделения определяется отношением рас­стояния между максимумами хроматографических пиков к сум­ме ширин пиков.

Рассмотренные элементы теории хроматографии являются общими для всех видов хроматографии, указанных выше.

На эффективность разделения компонентов в хроматогра-фическом процессе влияет очень много факторов. Сорбент (твер­дый или жидкий) должен обладать определенной селективно­стью. Элюент должен быть инертным по отношению к компо­нентам и сорбенту, обладать малой вязкостью, обеспечивать вы­сокую чувствительность детектора. При хроматографировании растворов часто применяют комплексообразующие вещества, которые способствуют разделению компонентов (разное вымы­вание компонентов с сорбента — изменяются константы Генри). Уменьшение скорости элюирования приближает процесс к рав­новесному и улучшает разделение компонентов. Если с увеличснием длины колонки растет степень разделения, то увеличение ее диаметра приводит, как правило, к ухудшению разделения вследствие конвекционного перемешивания разделяемой смеси.

Эффективность разделения зависит также и от конструктив­ных особенностей колонки, размеров частиц сорбента и качест­ва их упаковки. Все это в значительной мере определяет число актов сорбции-десорбции, приходящееся на единицу длины ко­лонки (число теоретических тарелок) и степень размывания пиков.

Кроме колоночной хроматографии, широко используемой в разнообразных вариантах, получила распространение и плос­костная хроматография, особенно ее разновидность — бумажная хроматография. Она выполняется на специальной хроматогра-фической бумаге, обладающей изотропностью по всем направле­ниям, равномерной плотностью и толщиной. На такую бумагу можно нанести осадитель или вещество с ионообменными свой­ствами, и тогда ее можно использовать для осадительной или ионообменной хроматографии. Хроматографическая бумага весь­ма гигроскопична, в ее порах и капиллярах при нормальных условиях удерживается более 20% влаги. Процесс разделения на такой бумаге напоминает распределительную хроматогра­фию, в которой неподвижной фазой является вода. На бумагу наносят разделяемую смесь и один край листа опускают в рас­творитель. Под действием капиллярных сил растворитель дви­жется вдоль листа и захватывает разделяемые вещества, ско­рость переноса которых зависит от их коэффициентов распреде­ления между фазами. Чем больше коэффициент распределения, тем меньше скорость движения. Ко­личественная оценка процесса ведется с помощью коэффициента i, равного отношению скорости движения вещества к скорости движения элюента (растворителя). Коэффициент разделения равен отношению этих коэффициентов для двух веществ и про­порционален обратному отношению коэффициентов распределе­ния. Подобным образом проводится количественная оценка эф­фективности разделения компонентов смесей в тонкослойной хроматографии, которая отличается от хроматографии на бума­ге тем, что выполняется на тонких слоях различных адсорбен­тов, наносимых обычно на стеклянные пластинки.