ВКР: Вращательная диффузия молекул сывороточных альбуминов в растворах с ионным и нейтральным детергентами

Введение
Белки играют центральную роль в реализации и регуляции практически всех процессов жизнедеятельности, протекающих в организмах на молекулярном уровне, поэтому проблема взаимосвязи структуры и функции белковых макромолекул является одной из центральных в современной науке. Для того чтобы белки эффективно осуществляли свои функции, необходима определенная стабильность белковой макромолекулы. Белковые макромолекулы способны претерпевать структурные перестройки под действием различных агентов. В данной работе исследуются белки сывороточные альбумины – сывороточный альбумин человека (САЧ) и бычий сывороточный альбумин (БСА). Бычий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин человека – глобулярные белки семейства альбуминов, изоэлектрическая точка БСА – pI 4,9 и САЧ – pI 4,7, молекулярная масса БСА – 64 кДа и САЧ – 66,4 кДа. Сывороточные альбумины представляют собой белки плазмы крови. Способность их молекул связывать обширный круг лигандов определяет одну из основных функций этих белков – транспорт физиологических метаболитов. Основой взаимодействий молекул сывороточных альбуминов с лигандами является структурная подвижность этих белковых молекул, обеспеченная петлевой укладкой единственной полипептидной цепи каждого из белков, состоящей из 585 (САЧ) и 582 (БСА) аминокислотных остатков. Третичная структура обоих белков (САЧ и БСА) определяется тремя доменами, каждый из которых состоит из двух субдоменов. Оба белка являются типичными представителями белков семейства альбуминов и имеют схожее строение с небольшими различиями, в частности, в отличие от САЧ, имеющего один остаток триптофана (Trp 214), БСА имеет в своей аминокислотной цепи два остатка триптофана – Trp 135 и Trp 214. В исследовании белков широко применяются детергенты, как ионные, так и нейтральные. Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детергенты – вещества, содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функциональную группу. Ярким примером денатурирующих агентов является анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН). Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной конформации. Этот процесс носит название денатурации белков. При денатурации белков не происходит разрыва пептидных связей, т.е. первичная структура белка не нарушается. Денатурация, как правило, сопровождается утратой специфических функций белков, что обуславливает интерес к изучению механизмов белковой денатурации.
Нейтральные детергенты используют для выделения интегральных мембранных белков и получения их в активной биохимической форме, а также для перевода глобулярных водорастворимых белков из водной среды в липидную среду. Для этой цели необходимы детергенты, позволяющие солюбилизовать белки и сохранить их в растворе. При солюбилизации происходит встраивание молекул белка в мицеллы детергента. Основная проблема в вопросах солюбилизации белков – это подбор оптимальных условий солюбилизации исследуемого белка. Ионные детергенты, денатурирующие белки (например, ДСН), не подходят для решения такой деликатной задачи. Для солюбилизации нужны такие детергенты, которые не нарушали бы вторичную и третичную структуры белка, а лишь связывались с гидрофобными участками белковой молекулы. Для солюбилизации белков необходимо учитывать заряд детергента (лучше нейтральный детергент), его ККМ (критическую концентрацию мицеллообразования) и размер мицелл детергента. Нейтральные детергенты, в основном, солюбилизируют белки, не повреждая их. Среди детергентов, часто применяющихся в биохимических, медицинских и фармацевтических исследованиях для солюбилизации белков, можно выделить нейтральный детергент Тритон Х-100. Целью данной работы является исследование по анализу триптофановой флуоресценции сывороточных альбуминов вращательной диффузии молекул этих белков в растворах с ионным (ДСН) и нейтральным (Тритон Х-100) детергентами. В рамках данной цели поставлены следующие задачи: 1. по анализу поляризованной триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека исследовать вращательную диффузию молекул этого белка в растворах анионного детергента ДСН и получить информацию о механизме денатурации альбумина человека под действием ДСН при различных значениях pH; 2. по анализу поляризованной триптофановой флуоресценции сывороточных альбуминов человека и быка исследовать вращательную диффузию молекул этих белков в растворах нейтрального детергента Тритона Х-100 и получить информацию о солюбилизации сывороточных альбуминов с помощью этого нейтрального детергента при различных значениях pH. Эти исследования чрезвычайно важны в связи с физиологическими функциями сывороточных альбуминов в крови, т.к. позволяют делать выводы об уровне сохранения нативной конформации белков и, следовательно, о сохранности их функциональных свойств в различных условиях, в частности, в растворах, содержащих детергенты, наиболее часто используемые в биохимических, медицинских и фармацевтических задачах.

Глава 1. Флуоресцентная спектроскопия в исследованиях взаимодействия белков и детергентов (литературный обзор)
§1.1. Физические основы поляризованной флуоресцентной спектроскопии

Свечение вещества, возникающее при переходе молекул из возбужденного состояния в основное, называют люминесценцией [1]. Если возбуждение происходило за счёт поглощения электромагнитного излучения в оптической области, то испускание излучения в процессе релаксации носит название фотолюминесценции. Люминесценция (рис. 1.1) подразделяется на два вида (флуоресценцию и фосфоресценцию) в зависимости от характера электронного состояния, из которого молекулы переходят в основное состояние с испусканием электромагнитного излучения [1-3]. При переходе с испусканием излучения между состояниями, имеющими одинаковую мультиплетность, наблюдается флуоресценция: обычно между синглетными первым возбужденным и основным состояниями S1 → S0. Среднее время жизни молекулы в возбужденном синглетном состоянии мало, и явление флуоресценции связано с высокой вероятностью перехода молекул в основное синглетное состояние. Флуоресценция характеризуется отсутствием длительного «послесвечения». Оптические переходы с испусканием излучения между электронными состояниями разной мультиплетности, обычно нижним возбужденным триплетным и основным синглетным T1 → S0, приводят к явлению фосфоресценции. По причине большого естественного времени жизни триплетного состояния и очень малой вероятности данного перехода константа скорости затухания фосфоресценции мала, что и объясняет длительное «послесвечение» фосфоресценции. Возможные безызлучательные переходы между различными электронными состояниями одной и той же мультиплетности называются внутренней конверсией. Возможные безызлучательные переходы между различными электронными состояниями разной мультиплетности называются интеркомбинационной конверсией. Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Спектр испускания флуоресценции представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны (или волнового числа) при фиксированной длине волны возбуждающего света. Спектром возбуждения называют зависимость интенсивности испускания флуоресценции от длины волны (или волнового числа) возбуждающего света при постоянном потоке фотонов, падающих на образец. Длина волны испускания при регистрации спектра возбуждения остается неизменной, а значения длины волны возбуждения (волновых чисел линии возбуждения) пробегают значения заданного диапазона