Диссертация: Технология получения и методы применения биопрепаратов на основе клубеньковых бактерий.

Актуальность темы исследования По решению Правительственной комиссии по высоким технологиям и инновациям от 1 апреля 2011 г. была разработана Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации №1853п-П8, утвержденная Председателем Правительства РФ. Данная Программа призвана заложить системные основы развития биотехнологии и биоэкономики в России, а также обеспечить базу для индустриального развития технологий микробного синтеза, нацеленных, в том числе, на выпуск биопрепаратов для сельского хозяйства. К данному направлению относится широкий спектр продуктов на основе различных микроорганизмов: биоконсерванты растительного сырья (силосные закваски), пищевые добавки для скота и птицы (пробиотики), биологические средства защиты растений (биопестициды), биоудобрения на основе микроорганизмов, вступающих в мутуалистические взаимоотношения с растениями (Коломиец Э.И. Микробные биотехнологии как основа экологизации и повышения продуктивности сельскохозяйственного производства // Микробные биотехнологии: сб. науч. тр. Минск, 2018. Т. 10. С. 3–11). Для формирования эффективных растительно-микробных ассоциаций в сельскохозяйственной практике используют биопрепараты на основе ассоциативной и симбиотической микрофлоры. К последней относятся клубеньковые бактерии (ризобии), способные вступать в тесные мутуалистические взаимодействия с бобовыми растениями с образованием азотиксирующего бобово-ризобиального симбиоза. Симбиотическая азотфиксация обеспечивает весь агроценоз легкоусваиваемыми формами азота, что повышает его продуктивность и позволяет отказаться от применения дорогостоящих и экологически небезопасных минеральных азотных удобрений при возделывании бобовых агрокультур. В отечественном сельском хозяйстве прием предпосевной инокуляции семян имеет ограниченное распространение. Связано это с тем, что эффективность инокулянтов значительно снижается при переходе с опытного на производственный уровень, который подразумевает промышленную технологию культивирования ризобий, длительное хранение инокулянтов в складских условиях, практику смешения препаратов ризобий с пестицидами и длительную выдержку обработанных семян перед посевом (рис. 1). Несмотря на большое количество работ, посвященных генетическим аспектам конструирования эффективных бобово-ризобиальных симбиозов (И.А. Тихонович, Н.А. Проворов, М.Л. Румянцева, А.Х. Баймиев и др.) и популяционной экологии клубеньковых бактерий (А.П. Кожемяков, С.А. Четкова и др.), до сих пор не решена проблема низкой интегрированности приема предпосевной инокуляции семян с современными агротехнологиями, что не позволяет раскрыть потенциал продуктивности бобово-ризобиального симбиоза в производственных условиях.
Степень разработанности темы исследования Проблема низкой эффективности препаратов ризобий в условиях сельскохозяйственного производства является комплексной, так как образование эффективных клубеньков на корнях бобовой агрокультуры является результатом действия целой совокупности факторов. Помимо высокой симбиотической совместимости партнеров и благоприятных почвенно-климатических условий образования симбиоза, “успех” инокуляции обусловлен такими параметрами как: титр ризобий на момент применения препарата (т.е. использования инокулянта для приготовления рабочего раствора), состав и концентрация химических протравителей в составе рабочего раствора, устойчивость ризобий к химическому стрессу и время прямого контакта бактерий с пестицидами, устойчивость ризобий к высыханию на обработанных семенах, эффективность протектора, обеспечивающего защиту бактерий от осмотического стресса и время, прошедшее с момента обработки семян до их заделки в почву. Каждый из вышеприведенных аспектов изучался различными коллективами исследователей, однако степень разработанности данных факторов существенно варьирует. Так, проблеме низкого титра бактерий на момент применения биопрепарата посвящено множество исследований, в том числе работы по совершенствованию рецептур питательных сред, обеспечивающих повышенный титр ризобий в жидкой культуре (Sayeda M. Ali, Gamil Amin, Mohammed Fayez, Mahmoud ElTahan, Mohammed Monib & Nabil A. Hegazi Production of rhizobia biofertilizers using baker's yeast effluent and their application to Leucaena leucocephala, Archives of Agronomy and Soil Science, 2005, 51:6, 605-617) и изучены факторы, влияющие на сохранность ризобий в процессе хранения препаратов (Лактионов Ю.В., Попова Т.А., Андреева О.А., Ибаттулина Р.П., Кожемяков А.П. Создание стабильной формы ростостимулирующих микробиологических препаратов и их эффективность // В сб.: Современные подходы в биотехнологии Республики Татарстан. – Казань, 2013. – 34-38 с). Кроме того, рядом исследователей выявлена возможность модификации жидких культур ризобий различными композициями полимеров, повышающих устойчивость бактерий к различным стресс-факторам, что позволяет увеличить срок хранения инокулянта и, в конечном итоге, обеспечить наибольшее количество жизнеспособных клеток на момент применения препарата (Das, K., Prasanna, R., and Saxena, A. K. Rhizobia: a potential biocontrol agent for soilborne fungal pathogens. Folia Microbiol. 2017. 62, 425–435). В связи с продолжающимся трендом на интенсификацию сельского хозяйства большое число исследований посвящено изучению степени токсичности различных марок ХСЗР для ризобий (Борзенкова Г.А.Применение эффективных протравителей и инокулянтов в технологии возделывания различных сортов сои // Земледелие. – 2014. - №4. – 37-39 с.) При этом, недостаточно изученным остается вопрос о том, какие именно компоненты пестицида определяют его токсичность для бактерий, а также каким образом возможно повысить устойчивость клубуньковых бактерий к токсическому стрессу при контакте бактерий с пестицидами в рабочем растворе. Относительно малоизученным является вопрос о степени устойчивости того или иного штамма ризобий к осмотическому стрессу, которому подвергаются бактерии при их высыхании на обработанных семенах (Vriezen, J. A. C., F. J. de Bruijn, and K. Nu¨sslein. Desiccation responses and survival of Sinorhizobium meliloti USDA 1021 in relation to growth-phase, temperature, chloride and sulfate availability. // Lett. Appl. Microbiol. – 2006. - №42. – 172–178 р). Данный пробел, очевидно, требует восполнения, так как подавляющее большинство современных агротехнологий возделывания бобовых подразумевает применение инокулянтов с помощью предпосевной обработки семян с их последующей выдержкой (по экономическим и технологическим причинам) в течение нескольких суток перед посевом. В течение данного времени титр ризобий на семени может как незначительно упасть (при условии высокой осмотической устойчивости штамма и эффективности протектора), так и сократиться до нуля ввиду чувствительности бактерий к высыханию и низкой эффективности или полном отсутствии протектора в составе рабочего раствора. Стоит отметить, что данные по эффективности различных веществ в качестве протектора ризобий, защищающих бактерии от высыхания на обработанных семенах носят отрывочный и, зачастую, противоречивый характер (Титова Л.В., Бровко И.С., Леонова Н.О., Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Патыка В.Ф. Роль липкогенных компонентов в повышении физиологической активности ризобий и продуктивности соево-ризобиального симбиоза // Мiкробiол., журн. – 2012. – № 4 (6), – С. 9–16.).
Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в совершенствовании технологии получения и применения препаратов клубеньковых бактерий, с последующей оценкой ее эффективности в производственных условиях. В соответствии с целью были определены следующие задачи: 1. сравнить производительность периодического и полунепрерывного (отъемно-доливного) режимов культивирования медленнорастущих видов клубеньковых бактерий; 2. определить степень стабильности препаратов ризобий в процессе полугодового хранения жидких инокулянтов в герметичных пластиковых канистрах и в двойных поливинилхлоридных пакетах, поддерживающих газообмен с окружающей средой; 3. выработать рекомендации по эффективному совмещению в один технологический прием метода обработки семян инокулянтами быстро- и медленнорастущих видов клубеньковых бактерий и метода обработки семян широко применяемыми химическими фунгицидами; 4. оценить перспективность введения в состав биопрепаратов водорастворимых полимеров, полисахаридов или сахаридов, применение которых должно позволить увеличить допустимый временной интервал между обработкой семян и их посевом.
Научно-практическая новизна исследования 1. Впервые для производства препаратов медленнорастущих видов ризобий использован полунепрерывный режим культивирования в ферментерах с рабочим объемом 500 л. Показано, что полунепрерывный режим культивирования является более производительным в сравнении с периодическим режимом; 2. Впервые в качестве упаковочного материала для хранения препаратов ризобий сои и люпина использован пакет из двойной поливинилхлоридной пленки, что способствует сохранению высокого титра клеток клубеньковых бактерий в процессе полугодового хранения жидких биопрепаратов; 3. Впервые проведено сравнение эффективности водорастворимых полимеров, полисахаридов и сахаридов в качестве протектора нанесенных на семена клубеньковых бактерий. Благодаря добавлению данных веществ к раствору инокулянта, на обрабатываемых им семенах образуется защитная пленка, снижающая скорость сокращения числа жизнеспособных ризобий, что позволяет осуществлять эффективную заблаговременную инокуляцию семян; 4. Впервые определено, что температура бакового раствора, содержащего химический фунгицид и клубеньковые бактерии, значительно влияет на жизнеспособность последних. Показано, что протравители на основе одного и того же действующего вещества (флудиоксонил), но произведенным по различным технологиям («Максим» и «Протект») могут различаться по токсическому воздействию, оказываемому на клетки быстро- и медленнорастущих видов ризобий.
Теоретическая и практическая значимость исследования Показана высокая производительность полунепрерывного режима культивирования при производстве препаратов ризобий медленнорастущих видов B. japonicum шт. 634б и B. lupini шт. 363а. Оценена стабильность биопрепаратов в процессе их полугодового хранения в упаковках из различных материалов в складских условиях. Оценена токсичность широко применяемых пестицидных протравителей семян для клубеньковых бактерий инокулянтов. Показано, что быстрорастущие виды ризобий более чувствительны к токсическому действию фунгицидов, чем медленнорастущие. Тем не менее, для быстрорастущих видов ризобий могут быть подобраны условия, повышающие их устойчивость к химическим пестицидам. Определена эффективность применения ряда водорастворимых полимеров, полисахаридов и сахаридов в качестве добавок, защищающих бактерии от высыхания на обработанных семенах.
Объекты исследования Объектами исследования служили штаммы медленнорастущих ризобий сои (B. japonicum шт. 634б, 640, BP-648, BP-733) и люпина (B. lupini шт. 363а, 367а), и штаммы быстрорастущих ризобий гороха (R. leguminosarum b. viciae шт. 260б) и чечевицы (R. leguminosarum bv. viciae шт. 712) из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ. В качестве химических пестицидных протравителей семян исследовали смачивающиеся порошки Беномил, Бенорад Фундазол и концентраты суспензий Максим, Протект, Протект Форте, Синклер, Оплот, Тирада. В качестве водорастворимых полимеров изучали поливинилпирролидон и поливиниловый спирт, в качестве водорастворимых полисахаридов и сахаридов изучали альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу и трегалозу.