Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 3

В результатепроведенных исследований определены новые свойства широко используемых вкардиологииклассических БМКК в отношении регуляции образованиясоединительной ткани, изучены их фармакодинамические характеристики,выявлен наиболее эффективный длярегуляции избыточного фиброгенезапрепарат – верапамил, что легло в основу создания новой лекарственной формы антирубцового крема с оценкой эффективности его применения.Для изучения механизмов формирования перитонеальных спаек иисследованийлекарственныхсоединительнойтканисредствсозданакоррекцииадекватнаяизбыточногоростауниверсальнаямодельспайкообразования на основе введения аутокрови в брюшную полость разныхвидов животных (патент 2260854 РФ).В разработанной модели с помощью клеточных технологий определенафармакологическаяпроизводныхэффективностьфенилалкиламинадействия(верапамил),различныхгруппбензотиазепинаБМКК:(дилтиазем),дигидропиридина (нифедипин) на образование заместительной соединительнойткани путем регуляции функции основных клеток соединительной ткани фибробластов и клеток их микроокружения.Выявлено, что верапамил является наиболее эффективным препаратом длярегуляции избыточного фиброгенеза с универсальным механизмом действия наразные типы фибробластов (перитонеальные фибробласты крысы и дермальные16фибробласты человека).

Обоснован дозовый режим (0,1 мг/ кг массы тела)внутрибрюшинного введения верапамила, оптимальный для профилактикиизбыточного роста соединительной ткани при спайкообразовании с отсутствиемкардио- и гемодинамических эффектов.Разработана новая лекарственная форма верапамила для местноговоздействиянаформирующийсягипертрофический/келоидныйрубец–антирубцовый крем (патент 2290919 РФ). В фармакологических экспериментахустановлена эффективность крема, проявляющаясясокращением площадипатологического кожного рубца, нормализацией его цвета, уменьшениемболезненности при его пальпации.

Структурное созревание рубцовой тканипроисходит в более ранние сроки, без признаковморфологическимиисследованиями.гипертрофии, что доказаноВерапамилукорачивалвсефазывоспаления, усиливал репаративные процессы, блокировал гипертрофию иприводил к преимущественному формированию физиологических рубцов.Методология и методы работыРеализована методология изучения фармакодинамической активностиБМКК в отношении соединительной ткани и ее основных клеток - фибробластов:отформулировкирабочейгипотезычерезвнедрениеадекватнойэкспериментальной модели и проведение исследований in vivo и in vitro, досоздания новой лекарственной формы антирубцового крема с верапамилом.Всесторонние доклинические испытания новых свойств БМКК на живыхсистемах проводились in vivo на целостном организме (447 животных- крысы,кролики) и in vitro на 720 первичных культурах перитонеальных фибробластов имакрофагов и на 160перевиваемых культурах дермальных фибробластовчеловека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience).Проведены фармакотехнологические исследования по разработке оптимальногосостава антирубцового крема с верапамилом.17Эксперименты выполнялись на 383 белых крысах самцах, массой 200 –240 граммов и 64 кроликах самцах породы Шиншилла, массой 2500 – 3200граммов.

На этапе планирования экспериментов строго учитывались требованияЕвропейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу заподопытными животными, выведению их из эксперимента и последующейутилизации. При осуществлении опытов руководствовались требованиямиВсемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции позащите экспериментальных животных 86/609.

На первом этапе экспериментовразрабатывалсяспособмоделированиявнутрибрюшинныхспаек(гемоперитонеум) у крыс и кроликов (патент 2260854 РФ).На втором этапе проведено 6 серий экспериментов:1-ая серия -in vivoпеританеальныхспаек,исследовали морфологические характеристикибиохимическийсоставицитокиновыйпрофильперитонеальной жидкости на 7, 10 сутки после моделирования гемоперитонеума укрыс;2-я серия - in vitro тестировали БМКК: верапамил, дилтиазем и нифедипин вразных дозовых режимах на первичных культурах перитонеальных фибробластовкрыс с гемоперитонеумом;3-я серия -in vivo, после выявления в культуральном модуле препарата снаиболее выраженным фармакологическим эффектом (верапамил), оценили егодействие на формирование соединительной ткани в целостном организме крыс,определили режим дозирования верапамила,исходя из необходимостиминимизировать кардио- и гемодинамические эффекты препарата;4-я серия - in vivo, для подтверждения универсальности разработанной моделиспайкообразования и идентичности действия верапамила у разных видовживотных,проведеныэкспериментынакроликасоценкойморфо-функциональных характеристик процесса спайкообразования;5 серия - in vitro, для выявления универсальности действия верапамила на разныетипы фибробластов (перитонеальные фибробласты крысы и дермальныефибробласты человека) тестировали БМКК: верапамил, дилтиазем и нифедипин18на перевиваемой культуре дермальных фибробластов человека (Human DermalFibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience).На основании полученных экспериментальных данных сформулированаконцепция разработки новой лекарственной формы верапамила для местноговоздействиянаформирующийсягипертрофический/келоидныйрубец–антирубцового крема, содержащего 0,25% раствор верапамила гидрохлорида,ланолин, вазелин, димексид (патент 2290919 РФ).6-я серия - in vivo, для оценки эффективности оригинального антирубцовогокрема, после моделирования патологических рубцов кожи на них дважды в деньнаносиликрем с верапамилом и сравнивали срезультатами аналогичноговоздействия на рубцы основы крема без верапамила.

Для подтверждениябезопасности крема его втирали в неповрежденный участок кожи. Морфофункциональные исследования проводили на 10, 30 и 60 сутки лечения.Длярешенияпоставленныхцелиизадачиспользовалисьфармакологические,фармацевтические,экспериментальные,культуральные,морфологические,биохимические,иммунологические,клинические,функциональные и статистические методы исследований.Положения, выносимые на защиту1.В основе спаечного процесса в брюшной полости крыс икроликов при моделировании гемоперитонеума (патент 2260854 РФ)лежат механизмы активации фибробластов с усилением их пролиферации,синтеза коллагена и гликозаминогликанов, активацией ядерного факторатранскрипции NF-κB, приводящей к блокированию апоптоза, ростомфункциональной активности макрофагов и синтеза провоспалительныхцитокинов TNF- и IL-1.2.БМККпроизводныефенилалкиламина(верапамил)ибензотиазепина (дилтиазем) в культурах активированных перитонеальных19клетокидермальныхфармакологическийперитонеальныхфибробластовэффектвоказываютотношениифибробластовивыраженныйизбыточноймакрофагов,активностиингибируяихпролиферативную активность, избыточную продукцию компонентовмежклеточногоматриксаицитокинов,угнетаятранскрипционного ядерного фактора NF-kBэкспрессиюперитонеальных идермальных фибробластов.

Эффективность верапамила в эквимолярныхдозах вдвое выше. Производные дигидропиридина (нифедипин) данныхэффектов не проявляют.3.Доза верапамила 0,1 мг/кг массы тела при внутрибрюшинномвведении не вызывает значимых изменений кардио- и гемодинамики иявляется оптимальной для профилактики спайкообразования, тормозяизбыточноеразрастаниесоединительнойтканипутемрегуляцииактивности фибробластов и макрофагов, приводящей к снижению уровнябелковосвязанногооксипролина,гиалуроновойкислоты,провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-1 в перитонеальной жидкостикрыс и кроликов.4. Разработан оптимальный состав и технология оригинальногоантирубцового крема с верапамилом (патент 2900919 РФ).

Соотношениялекарственного средства и вода-вазелин-ланолиновой основы 3:6:1обеспечиваетоптимальнуюскоростьиполнотувысвобожденияверапамила из крема. В опытах in vivo изучено антирубцовое действиекрема при накожном нанесении и установлена его высокая специфическаяактивность,проявляющаясяповерхностисфизиологические.уменьшениемтрансформациейПрименениеплощадипатологическихкремаявляетсярубцоврубцовойкоживбезболезненным,безопасным.Степень достоверности и апробация результатов20Достоверностьполученныхрезультатовобусловленадостаточнымобъемом и корректным формированием изучаемых выборок, широким спектромивысокойинформативностьюсовременныхметодовисследования,многоуровневым тестированием in vitro и in vivo, положительными решениями порезультатам патентной экспертизы результатов исследования с выдачей патентовРФ на изобретения (№ 2260854, № 2900919), адекватностью аналитическихметодовстатистическойобработкиполученныхданных,публикациямирезультатов исследования в рецензируемых научных изданиях.Материалы и основные положения диссертации представлены на IXнациональном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002);конгрессепоклиническойМежрегиональнойнаправленияииммуннойнаучно-практическойразвитиярегиональногопатологииВсемирном(Сингапур,конференции2002);«Современныездравоохранения»(Омск,2005);Международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана:интеграциянауки,Всероссийскойобразованияконференцииипроизводства»(Шимкент«Актуальныепроблемы2008);XLIIIтеоретической,экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень 2009);IIнаучно-практической конференции с международным участием «Достиженияклинической фармакологии в России» (Москва 2009); VI Дальневосточномрегиональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство»(Владивосток 2009); научно-практической конференции «Фармацевтическаянаука и практика: достижения и перспективы» (Кемерово 2009); LXVрегиональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск 2010); XVIIРоссийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2010); IIМеждународнойконференции«Актуальныепроблемыбиохимииибионанотехнологий» (Казань 2011); XIX Российском национальном конгрессе«Человек и лекарство» (Москва 2012); V Международной научно-методическойконференции«Путииформысовершенствованияфармацевтическогообразования.