Автореферат (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 8

%)123430405060231915117654403530251001001001005707320100Проведен диализ каждой смеси через полупроницаемую мембрану с отбором диализатаи определением в нем количества верапамила методом обращенно-фазовой высокоэффективнойжидкостной хроматографии высокого давления в изократическом режиме. Результатыпослужили основанием выбора оптимального соотношения лекарственного средства и водавазелин-ланолиновой основы в используемых смесях, обеспечивавшего лучшую скорость иполноту высвобождения верапамила из крема, должную растекаемость и влагоемкость крема.Соотношение массовых долей указанных компонентов, обоснованное теоретически иподтвержденное стендовыми испытаниями, легло в основу созданияантирубцового кремаследующего состава:раствор верапамила 0,25% - 25-35% ; ланолин - 40-60%; вазелин – 11-19%;димексид - 4-6%Экспериментальная терапия верапамил-содержащим кремом в течение первых 10 днейпоказала эффективность у 65% крыс: рубцы стали более гладкими, с тенденцией квыравниванию до уровня здоровой кожи.

Окраска рубцов из ярко-красной, цианотичнойтрансформировалась в розовую. Более чем в половине случаев при пальпации исчезлаболезненность. Через 30 дней лечения произошло уменьшение площади рубцов на 12%. У 82%крыс цвет рубцов стал светло-розовым, высота рубцов в 65% сравнялась с уровнем кожи, ониимели гладкую поверхность, легко образуя складу. Через 60 дней площадь патологическихрубцов уменьшилась на 25%, у 87% животных рубцы стали тонкими, светлыми,безболезненными при пальпации. Оценка эффективности в баллах показала хороший результату крыс, пролеченных верапамилом (2,5 балла), и неудовлетворительный (11 баллов) у крысгруппы сравнения с нанесением на рубцы основы крема без верапамила.Проведение биомикроскопии кожи показало, что интенсивность поглощения световогопотока поверхностью рубца при лечении верапамилом регрессирует, возвращаясь кпоказателям здоровой кожи.

В динамике эти изменения носили плавный нарастающий31характер: через 10 дней лечения показатели составили 8,0 у.е. у 64% крыс, получавшихверапамил, и лишь у 18% крыс, его не получавших; через 30 дней - 14,5 у.е. соответственно у81 и 21% крыс, через 60 дней - 18,5 у.е. у 93% крыс, леченых с верапамилом, и 41% без него.При анализе рубцовой ткани белых крыс отмечены особенности ее строения взависимости от длительности применения лекарственных препаратов.

Через 10 суток посленачала лечения изменений не выявлено. В динамике на 30 - 60 сутки уменьшалось числопатологических рубцов и увеличивалась доля нормотрофических рубцов (таблица 7).Таблица 7. Характеристика кожных рубцов у крыс, получавших местное лечение верапамиломВид рубцовФормированиеОкончательная трансформациярубца10 сут30 сут60 сутС верапамилом (основная группа)Нормотрофические281629Гипертрофические33272083321КелоидныеигипертрофическиеБез верапамила (группа сравнения)Нормотрофические24812Гипертрофические332825223654КелоидныеигипертрофическиеРезультаты сравнения2=2=0,0;df=2;p = 1,02,5, 2=7,3, 2=8,3,df = 2,df = 2,df = 2,p = 0,28p = 0,027*p = 0,016*2 = 38,4, df = 10, p < 0,0001**Различия между группами статистически значимы при p <0,05Морфологические исследования показали, что через 10 суток лечения существенныхизменений в строении гипертрофических рубцов не произошло. Выявлялся папилломатозэпителия в эпидермисе, клетки базального слоя гиперхромные с высоким ядерноцитоплазматическим индексом, вакуольная дистрофия эпителиоцитов, грубые толстыеколлагеновые волокна.

Через 30 и 60 суток процессы трансформации патологических рубцов внормотрофические под действием верапамила существенно усиливались. Через 30 сутокпримененияверапамилаопределялисьтолько32единичныеочаговыеперивазальныелимфогистиоцитарные инфильтраты. Исключительно в глубоких отделах гипертрофическихрубцов выявлялось очаговое набухание с гомогенизацией коллагеновых пучков. Междупучками сформированных коллагеновых волокон определялись фибробласты и фиброциты.Через 60 суток у животных основной группы в рубцах пучки коллагеновых волоконприобретали вид структурно сформированных компактных образований, между которымирасполагалось умеренное количество фиброцитов. Рубцы из гипертрофических превращались внормотрофические.

В поверхностных отделах рубцов преобладали расширенные капилляры соструктурно сформированными стенками, в более глубоких слоях – немногочисленные артериии артериолы с толстыми стенками из 3-4 рядов гладкомышечных клеток, волокнистых структури единичных уплощенных эндотелиоцитов. В структуре эпидермиса встречались признакигиперкератоза.Нанесение антирубцового крема на неповрежденную кожу не вызывало признаков ееизменения. В течение всего периода наблюдения (60 сутки) на месте контакта крема с кожейпризнаки воспаления и/или аллергических реакций отсутствовали.Таким образом, местное применение верапамила в составе антирубцового кремаприводило к трансформации патологических рубцов кожи в нормотрофические.

Этовыражалось в более раннем структурном созревании сосудисто-стромальных элементов безгипертрофии. Использование верапамила усиливало репаративные процессы, укорачивало всефазы воспаления, блокировало гипертрофию и, в результате, приводило к преимущественномуформированию физиологических рубцов.ЗАКЛЮЧЕНИЕВажнейшим итогом настоящей работы является экспериментально обоснованнаяконцепция новой области медицинского применения лекарственных средств группыблокаторов медленных кальциевых каналов для регуляции образования соединительной тканипри спайко- и рубцовообразовании.Проведенное фармакодинамическое исследование доказывает наличие у БМКК группфенилалкиламинов (верапамил) и бензотиазепинов (дилтиазем) свойств, регулирующихактивностьфибробластов;приэтомместноеприменениеверапамилаэффективнопредотвращает у крыс и кроликов формирование перитонеальных спаек (в дозах, не влияющихна кардио- и гемодинамику) и патологических рубцов кожи.Изучены и уточнены компоненты патогенеза спаечного процесса и образованияпатологических рубцов кожи, механизмы действия БМКК верапамила, дилтиазема, нифедипинана формирование заместительной соединительной ткани in vivo и in vitro.

Исследования in vitroпроведены в первичной культуре перитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом и33перевиваемой культуре дермальных фибробластов человека (производства Axol Bioscience).Способы in vivo основаны на запатентованной модели асептического перитонеальногоспайкообразования у крыс и кроликов, а также воспроизведении модели формированияпатологических рубцов кожи. Наличие спаечного процесса, патологических рубцов кожи былоподтверждено макро- и микроскопически.

Получены равнозначныеморфологические ифункциональные эквиваленты формирования спаечного процесса в брюшной полости разныхвидов лабораторных животных.Оценено влияние разных доз БМКК верапамила, дилтиазема, нифедипина на функциифибробластов и макрофагов, процессы пролиферации и ингибирования апоптоза, синтезаколлагена и цитокинов.

Установлен препарат, обладающий наибольшей фармакологическойэффективностью – верапамил, который и подвергся углубленному исследованию in vivo наразных видах животных.Врезультатеисследованияклеточно-матриксныхмеханизмов,реализующихсячрезмерным образованием соединительной ткани при спайкообразовании, установленоувеличение активности фибробластов с усилением митотической активности и экспрессиитранскрипционного фактора NF-κB, темпов синтеза компонентов межклеточного матриксаколлагена и гликозаминогликанов, а также ростом пролиферативной активности макрофагов иизбыточным синтезом ими провоспалительных цитокинов TNF- и IL-1.

Доказано наличиесвязи между активностью фибробластов, макрофагов и выраженностью спайкообразования.Приверапамилом,изучениидозозависимойдилтиаземом,регуляциинифедипиномактивностиобнаруженофибробластовподавлениеБМККпролиферациииколлагенсинтетической функции фибробластов, снижение гиперактивности ядерного факторатранскрипции NF-κВ, приводящего к ингибированию процессов апоптоза, торможениемакрофагальной трансформации и темпов синтеза макрофагами провоспалительных цитокиновпод действием верапамила или дилтеазема. У нифедипина данный эффект выявлен не был.Наиболее выраженный модулирующий эффект наблюдался у верапамила в концентрации0,0001 мл-1.