Автореферат (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 7

Нифедипин не оказывалвлияния на активность ядерного фактора транскрипции (таблица 4).Исследование транскрипции NF-kB (р50/р65) в перевиваемой культуре дермальныхфибробластов человека показало, что стимуляции его активности TNF-α приводила к 5кратному повышению уровня NF-kB (таблица 5) относительно контрольных значений (150пг/мл). Введение верапамила в культуральную среду предотвращало активацию ядерногофактора транскрипции NF-kB, останавливая его наработку в течении 24 часов инкубации с0,00005 мл-1 препарата на уровне 87,5% (р<0,05), с 0,0001 мл-1 - на уровне 57,0% (р<0,001) отконтрольных показателей (таблица 5).Таблица 5.

Изменение содержания NF-kB (пг/мл) под влиянием БМКК в ядерныхэкстрактах культуры Human Dermal Fibroblasts (Adult)Показателиконцентрация0,00005 мл-10,0001 мл-1верапамил631,7±16,5*411,4±19,7***дилтиазем737,3±22,1^765,7±34,7^нифедипин720,2±32,1^771,1±24,5^^^Контроль (без лекарственных средств) 721,3±22,6Примечание:* - достоверность различий с группой без введения лекарственныхсредств, * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001. ^ - достоверность различий между группой сверапамилом и дилтиаземом, верапамилом и нифедипином (p<0,05).Дилтиазем и нефидипин не оказывали существенного действия на нормализациюгиперподукцииактивированного транскрипционного ядерного фактора NF-kB (р50/р65)дермальными фибробластами (таблица 5).Такимобразом,сравнениерезультатовдействияБМККнаактивностьтранскрипционного ядерного фактора NF-kB (р50/р65) в первичной культуре перитонеальныхклеток крыс и в перевиваемой культуре дермальных фибробластов человека выявило высокуюфармакологическую активность верапамила.

Эффект препарата был дозозависим. Выявленныезакономерностислужатфармакодинамическим объяснением механизма плейотропногоэффекта верапамила, направленного на подавление избыточного образования соединительнойткани.27Для определения оптимального дозового режима интраперитонеального введенияверапамила с минимизацией действия на сердечно-сосудистую систему в эксперименте изученовлияние убывающих доз верапамила (0,4; 0,2; 0,1 мг/кг массы тела животного) на системнуюкардио- и гемодинамику белых крыс. Установлено, что выраженное и достоверное влияние нагемодинамику верапамил оказывал в дозах 0,4 и 0,2 мг/кг массы тела животного привнутрибрюшинном введении в течение четырех и более, либо первых двух часов наблюдениясоответственно.При этом регистрировались достоверные отрицательный хронотропный(снижение ЧСС с 401,6±5,1 до 317,8±10,0 мин-1; p<0,05), кардиодепрессивный (уменьшениесердечного выброса – УО с 0,12±0,005 до 0,09±0,005 мл; p<0,05), артериолодилатирующий(снижение ОПСС с 0,27±0,02 до 0,18±0,01 дин∙см-5/103; p<0,05) и гипотензивный (снижениесреднего АД с 110,8±2,8 до 96,5±2,9 мм.

рт. ст.; p<0,05 ) эффекты верапамила, возникавшие ужек 15 минуте действия препарата. Наличие выраженных сердечно-сосудистых эффектовверапамила в дозах 0,4 и 0,2 мг/кг массы тела животного свидетельствовало о том, что длядостижения поставленной цели данные дозы были избыточными.При введении верапамила в дозе 0,1 мг/кг массы тела животного показатели,характеризующие работу сердца и состояние кровообращения, оставались неизменными исопоставимыми с исходными данными в течение всего срока наблюдения.

В данной дозеосновныефармакологическиесвойстваверапамиланепроявлялись:показатели,характеризующие работу сердца и состояние кровообращения, оставались на уровне исходныхданных в течение 15 минут (ЧСС от 401,5±5,1 до 393,3±4,4 мин-1, p>0,05; среднее АД от110,8±2,9 до 109,3±1,5 мм рт. ст., p>0,05; УО с 0,11±0,005 до 0,11±0,005 мл, p>0,05), 2 часов(ЧСС от 401,5±5,1 до 394,2±4,7 мин-1, p>0,05; среднее АД от 110,8±2,9 до 108,8±1,3 мм рт.

ст.,p>0,05; УО с 0,11±0,005 до 0,11±0,002 мл, p>0,05) и 4 часов (ЧСС от 401,5±5,1 до 399,7±4,5мин-1, p>0,05; среднее АД от 110,8±2,9 до 109,2±1,1 мм рт. ст., p>0,05; УО с 0,11±0,005 до0,11±0,005 мл, p>0,05) после инъекции препарата. Следовательно, оптимальной для изучениявлияния верапамила на процессы спайкообразования в брюшной полости является доза 0,1мг/кг массы тела животного, не вызывавшая при внутрибрюшинном введении значимых идостоверных изменений кардио- и гемодинамики.Внутрибрюшинное введение верапамила в дозе 0,1 мг/кг массы тела животного,одновременно с моделированием гемоперитонеума, принципиально меняло морфологическуюкартину спаечного процесса в брюшной полости.

Количество спаек достоверно (p<0,05)уменьшилось и составило 0,20±0,04 у крыс и 0,23±0,02 у кроликов с гемоперитонеумом против8,2±1,8верапамила.и 8,6±2,3 соответственно у животных без профилактического введенияСредиединичныхидентифицированныхспаекпреобладаливисцеро-париетальные.

Висцеро-висцеральные спайки (с сальником, печенью, селезенкой, кишечником,28мочевым пузырем) отсутствовали. Не было обнаружено тяжевых и плоскостных спаек. Внебольшом количестве выявлялись пленчатые, паутинные и смешанные спайки. Очевидно, чточисло перитонеальных спаек в условиях нашего эксперимента явилось своеобразнойхарактеристикой реактивности брюшины и ее изменений под действием верапамила.

На 7 суткипосле моделирования гемоперитонеума и введения в брюшную полость верапамила как у крыс,так и у кроликов спайки были представлены молодой грануляционной соединительной тканью,в которой присутствовали фибробласты, фиброциты, единичные многоядерные клетки. К 10суткамформироваласьсозревающиесоединительнотканныеспайкисхаотичнымрасположением коллагеновых волокон с преобладанием фибробластов и фиброцитов.Профилактическое введение верапамила крысам и кроликам определило снижениесодержания белковосвязанного оксипролина (до5,4±0,3 мкмоль/л против исходных7,5±0,6мкмоль/л у крыс и до 6,6±0,1 мкмоль/л против исходных 7,6±0,3 мкмоль/л у кроликов; p<0,05для обоих видов животных) в перитонеальной жидкости к 10 суткам после моделированиягемоперитонеума.

Установлена прямая и тесная корреляционная связь между количествомспаек и содержанием исследуемого биохимического субстрата в перитонеальной жидкости какв группе животных без профилактического введения лекарственных средств (r=0,92, p<0,05),так и при воздействии верапамила (r=0,76, p<0,05).Сопоставление уровней гиалуроновойкислоты в перитонеальной жидкости кроликов с гемоперитонеумом без введения верапамилаи в группе животных, получивших данное лекарственное средство одновременно смоделированием асептического воспаления брюшины, также выявило достоверное снижение ееуровня (до 0,8±0,02 мкмоль/л против 1,0±0,04 мкмоль/л в контроле, p<0,05) в результатедействия верапамила. При этом установлена прямая корреляция между числом перитонеальныхспаек и уровнем гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости (r=0,69, p<0,05).Активность верапамила как регулятора чрезмерной активности фибробластов приасептическом воспалении брюшины была подтверждена нами in vivo на разных видахживотных.

Внутрибрюшинное введение верапамилагемоперитонеумапредотвращалочрезмернуюодновременно с моделированиемактивациюклетокмоноцитарно-макрофагального ряда, снижая избыточную продукцию провоспалительных цитокинов: TNF-и IL- 1. Введение верапамила предотвращало избыточную наработку TNF- в среднем науровне 104,1±42,2 пг/л (р<0,01), IL- 1 на уровне 3,3±1,2 пг/л (р<0,01), что было соответственнов 2 и 3 раза ниже, чем в экспериментальной группе без лечения. При этом содержание IL-1 неотличалось от уровня контроля – интактных животных без гемоперитонеума (3,2±0,9 пг/л).Нормализация активности перитонеальных макрофагов, моделирующих, в том числе и черезсистему цитокинов, коллагенсинтезирующую29функциюфибробластов,поддействиемверапамила внесла свой вклад в предотвращение перитонеального спайкообразования приасептическом воспалении брюшины.Доказанная оптимизация функций фибробластов и образования соединительной тканипод действием верапамила у разных видов лабораторных животных, а также универсальностьего действия на молекулярные механизмы активации перитонеальных фибробластов крысы идермальных фибробластов человека явились патогенетическим обоснованием использованияверапамила как средства профилактики и лечения патологических кожных рубцов.

Полученныйэкспериментальный материал послужил основанием для создания новой лекарственной формыдля местного применения – антирубцового крема с верапамилом.Трансдермальная лекарственная форма верапамила – антирубцовый крем (патент2290919 РФ) разработана в соответствии с традиционной схемой создания наружныхлекарственных форм, предусматривающей: обоснование содержания действующих веществ;выбороптимальныхвспомогательныхкомпонентов(основы,консервантов),иназаключительном этапе - исследование фармакологической активности предложенного составакрема.Верапамил выбран действующим веществом антирубцового крема на основаниидоказательств in vitro и in vivo эффективности по предотвращению избыточного формированиязаместительной соединительной ткани.При выборе состава основы крема были исследованы следующие композиции:1.

Вода-вазелин-эмульгатор Т22. Вода-ланолин-вазелин3. Стеарин-вазелиновое масло-карбонат натрия-карбонат калия-вода4. Воск-спермацет-ланолин-персиковое масло-водаУстановлено, что основа вода-ланолин-вазелин оптимальна по водно-жировому балансуи лучше прочих способствует проникновению препарата через кожу в ткань рубца.

В качествеконсервирующего, противовоспалительного, антимикробного и противоотечного компонента, атакже для повышения проникающей способности крема в состав введен димексид в количестве4-6 мас.%. При биофармацевтическом изучении биодоступности действующего веществаизучены 5 смесей (таблица 6), содержащих различные количественные композицииантирубцового крема.30Таблица6.Количественныекомбинациикомпонентовантирубцовогокремав5экспериментальных смесях.КомпонентыЛанолин безводныйВазелинДимексид0,25 % р-ра верапамилаВсего:Смесь (содержание вещества, мас.