Автореферат (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 5

(1990), гиалуроновойкислоты - по карбазольной реакции Дише в модификации Шараева П.Н. с соавт. (1996).18Содержание провоспалительных цитокинов: TNF- и IL-1 исследовали методом ИФА спомощью наборов Rat IL-1β и TNF- ELISA Development Kit (PeproTech, США) в соответствиис протоколом, предложенным производителем.Изучениедозозависимоговлиянияверапамиланауровнисистолического,диастолического и среднего АД, периферическое сосудистое сопротивление и показателисердечного выброса проводили на полифизиографе МАИТ – 01 «Данко» производства ООО«Медицинскиесистемы»,городРостов-на-Донусэлектроманометрическим,электрокардиографическим и реографическим блоками.

Измерение АД производили прямымметодом путем катетеризации левой общей сонной артерии. Электрокардиографическиепоказатели регистрировались в стандартных отведениях с помощью игольчатых электродов,вводимых под кожу конечностей. Большинство показателей системной гемодинамикирассчитывалось по данным интегральной реографии и ее первой производной. Расчет величиныударного объема сердца, минутного объема кровообращения, общего периферическогосопротивления сосудов производили по стандартным формулам.Фармакотехнологическиевысокоэффективнойжидкостнойметодывключали:хроматографиипробоподготовку,(ВЭЖХ),способпроведениеприготовленияантирубцового крема.

В пробоподготовку входило получение модели биологической мембраныпутем приготовления 6% раствора лецитина в кипящем 95 мас.% спирте этиловом ипропитывания им мелкопористых бумажных фильтров; диализ с нанесением на биологическуюмембрану разработанного антирубцового крема, его погружение в воду, перемешивание итермостатирование с отбором через заданные промежутки времени проб дляопределениясодержания верапамила методом ВЭЖХ. Разделения выполнены на жидкостном хроматографе"Shimadzu LC-20 Prominence" (Япония) со спектрофотометрическим детектором (R=254 нм).Способ приготовления крема заключался в расплавлении ланолина, вазелина и смешивании сраствором верапамила, нагревании эмульсии до 60°, затем охлаждении до 40° и обработке накавитационной мельнице с последующим введением димексида.

Разработанный антирубцовыйкрем содержит 0,25% раствор верапамила гидрохлорида, ланолин, вазелин, димексид всоотношении 30: 60:10: 5 (патент 2290919 РФ).Исследование эффективности и безопасности антирубцового крема включалосравнительный анализ результатов экспериментальной терапии крысс патологическимирубцами кожи антирубцовым кремом или его основой без верапамила при ежедневном 2кратном втирании в зону рубца, а также нанесения крема нетравмированным крысам наздоровый участок кожи. Контроль эффективности и безопасности проводили через 10, 30 и 60суток с момента формирования рубцов.

Характеристику рубцовых повреждений кожи19проводили по шкале с оценкой в баллах с учетом размера, цвета и типа рубца, данныхсравнительной биомикроскопии. Сумма показателей шкалы до 5 баллов расценивалась какхороший результат, от 5 до 10 баллов - как удовлетворительный, более 10 баллов - какнеудовлетворительный. Сравнительную биомикроскопию рубцов проводили по А.

А.Чернецову(1988) на устройстве для микроскопии кожи в отраженном свете с фокусированиемполученногоизображениянапреобразователесветовыхсигналовМорфологические исследования биоптатов кожи крыс проводиливэлектрические.по общепринятымметодикам с окраской гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону.Размер выборки каждой группы для получения достоверных результатов определяли поформуле (Lopez-Jimenez F. et al., 1998).

Статистическую обработку данныхпроводили сиспользованием пакетов «Statistica 6,0 for Windows», биостатистика (StatSoft, Inc.США) и MSExcel в среде Windows. Вид распределения тестировали критерием Шапиро-Уилка. Во всехслучаях при возможности параметрического исследования применяли t-критерий Стьюдента.Если поставленные задачи не могли быть решены t-критерием, применяли непараметрическиеметоды, критерии Манна-Уитни, Вилкоксона, 2, критерий Колмогорова-Смирнова, при этом вкаждом конкретном случае предпочтение отдавалось наиболее чувствительному критерию.Корреляционный анализ показателей был проведен с помощью определения коэффициентакорреляции Пирсона или Спирмана. Количественный материал исследования представлен ввиде графиков и таблиц.

Средние выборочные значения количественных признаков приведеныв виде M – среднее выборочное, m – стандартная ошибка среднего. Данные, не подчинявшиесязакону нормального распределения, представлены в виде медианы (Me) и интерквартильногоразмаха (25 и 75-процентили). Во всех процедурах статистического анализа критическийуровень значимости статистических гипотез принимали равным 0,05.Результаты исследования и их обсуждениеМоделирование спаечного процесса (гемоперитонеума) в брюшной полости крыс икроликов, проведенное однотипно путем внутрибрюшинного введения аутокрови, приводилона 7-10 сутки к образованию множественных соединительнотканных спаек, количествокоторых было сопоставимо (у крыс 8,2±1,8, у кроликов 8,6±2,3, р>0,05). Спайки (висцеральнопариетальные и висцеро-висцеральные) преимущественно локализовались в каудальном этажебрюшной полости и макроскопически были разделены на тяжевые, плоскостные, пленчатые,паутинныеи смешанные.

Микроскопически спайки были представлены волокнистойсоединительной тканью, степень зрелости которой зависела от сроков наблюдения. Так от 7 к10 суткам фибринозные наложения и рыхлая соединительная ткань20с хаотичнымрасположением коллагеновых волокон организовывалась до зрелой соединительной ткани супорядоченным расположением коллагеновых волокон. Клеточный состав был представленфиброцитами, фибробластами, мононуклеарами, встречались единичные плазматические,тучные и многоядерные клетки, 2/3 поверхности спаек было покрыто мезотелиоцитами.Уровень спайкообразования, локализация спаек, их микроскопические характеристики вэкспериментах на крысах и на кроликах не разнились.Выраженноеактивностьюираспространенноеспайкообразованиесочеталосьсвысокойперитонеальных фибробластов и клеток их микроокружения - макрофагов.Исследование коллагенсинтетической функции фибробластов, заключающееся в определении вперитонеальной жидкости кроликов белковосвязанного оксипролина, продемонстрировало ростпоказателя к 10 суткам после моделирования гемоперитонеума.

Его значение превышалопоказатели контроля в 7 раз (7,6±0,3 мкмоль/л против 1,1±0,2 мкмоль/л в контроле, p<0,05).Уровень гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости также превышал контрольныезначения (1,0±0,04 ммоль/л против 0,3±0,01 ммоль/л в контроле, p<0,05). Установлена сильнаяпрямая корреляционная связь между количеством спаек и содержанием оксипролина (r=0,95,p<0,05), количеством спаек и содержанием гиалуроновой кислоты (r=0,93, p<0,05). Увеличениезначений показателей, характеризующих волокнистые структуры и аморфное веществосоединительной ткани, было взаимосвязано. Между количеством оксипролина и гиалуроновойкислоты имелась сильная прямая связь (r=0,86, p<0,05).Сравнительный анализ содержания провоспалительных цитокинов в перитонеальнойжидкости крыс на 10 сутки гемоперитонеума выявил, что количество TNF- превышалоконтрольные значения в 25 раз (251,1 ± 7,3 пг/мл против 10,3± 0,4 пг/мл, р<0,01), усилениесинтеза IL-1 достигало 3-х кратного увеличения (12,7 ± 0,8, пг/мл против 3,7 ± 0,3 пг/мл вконтроле).

Связь изменений содержания цитокинов с выраженностью спайкообразования былаподтверждена результатами корреляционного анализа. Выявлена прямая корреляция междуTNF- и числом спаек, IL-1 и числом спаек (r=0,55, p<0,05 и r=0,87, р<0,01 соответственно).Исследованиепролиферацииактивированныхinvivoфибробластовкрыссгемоперитонеумом в культуре клеток показало, что их митотическая активность через 24 часакультивирования была высокой, митотический индекс в 5,3 раза превышал показателинеактивированных фибробластов интактных крыс (12,3±0,4% против 2,3±0,2%, p<0,05) икоррелировал с числом соединительнотканных спаек (r=0,91, p<0,05). Экспрессия маркерапролиферации, напрямую связанного с делением клетки, белка Ki-67 в ядрах активированныхфибробластов составила 32,6±0,7%, что было почти в 8 раз выше, чем у интактных крыс, гдеантиген Ki-67 маркировал 3,7±0,3% клеток (p<0,05).21Повышенная пролиферативная активность фибробластов сопровождалась увеличениемихколлагенсинтетическойактивности.Уровеньбелковосвязанногооксипролинаактивированных фибробластов был в 4,2 раза выше, чем в культуре неактивированных клеток(26,7±1,7 против 6,5±0,4 мкмоль/л, p<0,05).

Отмечена прямая корреляционная связь междуколичеством белковосвязанного оксипролина и числом спаек вбрюшной полости крыс сгемоперитонеумом (r=0,78, р<0,05). Сравнительный анализ секретируемой фибробластамигиалуроновой кислоты, являющейся, наряду с коллагеном, одним из основных компонентовмежклеточного матрикса соединительной ткани, выявил 3-кратное увеличение ее синтезаактивированными in vivo перитонеальными фибробластами в результате моделирования у крысгемоперитонеума (1,6±0,12 ммоль/л против 0,5±0,03 ммоль/л, р<0,05).Исследование клеток микроокружения перитонеальных фибробластов выявило, чтомоноциты, полученные от крыс на 10 сутки гемоперитонеума, демонстрировали в культуревысокую способность к трансформации в макрофаги. В течение 24 часов культивирования 60,5± 3,1% из них дифференцировалось в макрофаги, что в 2,5 раза превышало показателинеактивированных клеток (24,1±5,2%, р<0,05).