Автореферат (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 4

Изданы монография и учебно-методическое пособие.Объем и структура диссертацииРабота изложена на 261 странице текста, проиллюстрирована 37 таблицами, 44рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методовисследования, 5 глав собственных исследований, главы обсуждения полученных результатов,заключения, выводов,и списка литературы, содержащего 571 источник, из них 296отечественных, 275 зарубежных авторов.Личный вклад автора13Личное участие автора выразилось в выборе направления исследования, проведениинаучно-информационного поиска, анализе и обобщении данных литературы и собственныхрезультатов.

Автором лично разработан дизайн и структура, определены цель и задачи научнойработы, проведены все этапы экспериментальных опытов, собраны и проанализированырезультаты инструментальных и лабораторных исследований, создана база данных, проведенастатистическая обработка материала, оформлены заявки на патенты, подготовлены монографияи методическое пособие, написан текст диссертации. Вклад автора является определяющим изаключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач иих реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах. Научныеположения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.06 – фармакология,клиническая фармакология.Внедрение результатов исследованияРезультаты проведенного исследования используются в учебном процессе кафедрфармакологии, клинической фармакологии ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России (Омск),кафедры фармацевтической технологии Пятигорского фармацевтического института - филиалаФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России, кафедры клинической фармакологии ФГБОУ ВОТюмГМУ Минздрава России (Тюмень).ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследованияЭкспериментальные исследования проведены на 383 белых крысах-самцах, массой 200– 240 г.

и 64 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой тела 2500 – 3200г., на720 первичных культурах перитонеальных фибробластов и макрофагов и на 160 перевиваемыхкультурах дермальных фибробластов человека. Выполнено 1542 эксперимента. Проведеныфармакотехнологические исследования по разработке антирубцового крема с верапамилом.ЭкспериментальныеисследованияпроводилинабазеЦНИЛГБОУВПО«Омскаягосударственная медицинская академия» МЗ России.

Животные, полученные из питомникаИнститута цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск),содержались в стандартныхусловиях вивария ЦНИЛ ОмГМА на обычном рационе при свободном доступе к воде и пище вусловиях нормального температурного и световогорежимов, с соблюдением требованийприказов № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также требований14Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу заподопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.Спаечный процесс крысам и кроликам моделировали однократным инъекционнымвнутрибрюшинным введением стерильнойаутокрови, забранной из дорсальной хвостовойвены у крыс и краевой вены уха кроликов, в количестве 1% массы тела (патент 2260854 РФ).Брюшинное спайкообразование регистрировали на 7-10 сутки.

Моделирование крысампатологических рубцовкожи проводили поС.В.Логвинову и Е.Г. Арий(2002). Подингаляционным масочным наркозом парами диэтилового эфира (ОАО «Медхимпром»)полнослойно иссекали лоскут кожи 5х4 см2 в центре спины в продольном направлении. Краякожногодефектаподшиваликподлежащиммышцам.На55суткиэкспериментаформировались обширные грубые послеоперационные рубцы.Исследования проводились in vivo на крысах, кроликах и in vitro в первичной культуреперитонеальных фибробластов и макрофагов крыс и перевиваемой культуре дермальныхфибробластов человека.

Дизайн экспериментального исследования фармакодинамическихэффектов БМКК верапамила,Экспериментыдилтиаземаинифедипинапредставлен на рисунке 1.проводились в два этапа. На первом этапе разрабатывался способмоделирования внутрибрюшинных спаек. На втором этапе проведена оценка эффективностиБМКК на разработанной модели спайкообразования (серии I, II, III на крысах и IV - накроликах), в перевиваемой культуре дермальных фибробластов человека (Human DermalFibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience (серия V), на крысах с патологическимикожными рубцами (се–ия VI). Также проведены технологические исследования и созданантирубцовый крем, содержащий 0,25% раствор верапамила гидрохлорида, ланолин, вазелин,димексид (патент 2290919 РФ).15Объект исследованияПеревиваемая культурадермальных фибробластовКрысы (n=277)Крысы с патологическимирубцами кожи (n=106)Кролики (n=64)Модель in vitro:Модель in vitro:Модель in vivo:перевиваемая культура HumanDermal Fibroblasts (n=160)культура активированныхперитонеальных фибробластови макрофагов крысы (n=720)аутогемоперитонеум сисходом вспайкообразованиеОсновнаягруппаГруппасравненияСредстваводные растворы БМККСредствоРазработка оптимальнойлекарственной формыводный раствор верапамилаверапамилдилтиазем0.00005 мл-10.00005 мл-1нифедипин0.00005 мл-10,1 мг/кгМазеваяосноваСредство0,4 мг/кг0,2 мг/кгверапамил (крем антирубцовый)0.0001 мл-10.0001 мл-10.0001 мл-1Методы исследования in vitroкультуральныеNF-kBиммуногистохимическиеМетоды исследования in vivoиммунологическиебиохимическиеМетоды исследованияфункциональныеморфологическиефармацевтическиеСтатистические методы исследования:параметрические (t-критерий Стьюдента) и непараметрические (Манна-Уитни, Вилкоксона,  , Колмогорова-Смирнова), корреляционный анализ216Рисунок 1.

Дизайн исследования фармакодинамических эффектов БМКК верапамила, дилтиазема инифедипина, направленных на регуляцию фиброгенезаВ I серии экспериментов исследовали морфологические характеристики спаек,биохимический состав и цитокиновый профиль перитонеальной жидкости.Во II серии in vitro на клеточных культурах тестировали БМКК: верапамил, дилтиаземи нифедипин с подбором оптимальной концентрации для выявления у них свойств регуляциифункции фибробластов и макрофагов при индукции спаечного процесса. Исследовалипролиферацию клеток: митотический индекс, маркер пролиферации Ki-67, активность ядерногофактора транскрипции NF-kB, темпы синтеза компонентов межклеточного матрикса:оксипролина, гиалуроновой кислоты, уровень провоспалительных цитокинов TNF-, IL-1.ВIII серии in vivo на крысах, после выявления БМКК, оказывающегонаиболеевыраженный фармакологический эффект в культуральном модуле - верапамила, провелиоценку эффективности его действия при внутрибрюшинном введении с определением режимадозирования, исходя из необходимости минимизировать кардио- и гемодинамические эффектыпрепарата.

Изучали влияние убывающих доз верапамила (0,4; 0,2; 0,1 мг/кг массы тела) насистемную кардио- и гемодинамику (ЧСС, АД, УО, МОК, ОПСС). Регистрация параметровгемодинамики и функций миокарда проводилась исходно, до введения верапамила и через 15минут, 2 часа и 4 часа после инъекции. Также исследованы процессы спайкообразования,синтезфибробластамикомпонентовмежклеточногоматрикса,цитокинсинтетическуюактивность макрофагов.В IV серии in vivo на кроликах для подтверждения универсальности действияверапамила и разработанной модели на разных видах животных выполнены исследования соценкойморфологическиххарактеристикперитонеальныхспаек,биохимическогоицитологического состава перитонеальной жидкости.V серия проведена in vitro на перевиваемой культуре дермальных фибробластовчеловека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience) с оценкой влиянияразличных концентраций верапамила, дилтиазема и нифедипина на активность ядерногофактора транскрипции NF-kB.В VI серии in vivo, после выбора верапамила в качестве действующего веществалекарственной формы для местного применения, проведения технологических исследований исоздания антирубцового крема, содержащего 0,25% раствор верапамила гидрохлорида,ланолин, вазелин, димексид (патент 2290919 РФ), на основании характеристики патологическихкожных рубцов,данных биомикроскопиии и морфологических исследований, обоснованаэффективность и безопасность применения оригинального крема для профилактики и леченияпатологических кожных рубцов.17Исследования первичных культур перитонеальных фибробластов и макрофагов крыс, атакже перевиваемой культуры дермальных фибробластов человека проводили по стандартнойтехнологии с использованием ростовой среды RPMI-1640 («Sigma») с добавлением 10%эмбриональной телячьей сыворотки, 2% глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/млстрептомицина, концентрации клеток 2х106/мл, инкубированием в течение 24 часов в условияхабсолютной влажности, 37ºС, 5% СО2.

Тестирование БММК верапамила (ОАО “Биосинтез”, г.Пенза, Россия),дилтиазема (Diltiazem Hydrochloride Injection, Hospira, США), нифедипина(Bayer, Германия) проводили в концентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1.Приготовление ядерных экстрактов для определения содержания ядерного фактора NFkB (р50/р65) в культурах как перитонеальных, так и дермальных фибробластов проводилось всоответствии с рекомендациями фирмы-производителя BCM Diagnostics (США). ОпределениеNF- kB (p50/p65) в образцах лизатов клеток проводили методом ИФА с помощью фотометраMultiscan MS (Labsystems, Финляндия), на реагентах BCM Diagnostics (США).Пролиферативную активность фибробластов оценивали в обычном гистологическомисследовании с окраскоймикроскопа(Axioscopпо Романовскому-Гимза.

С помощью бинокулярного светового«CarlZeiss»,Германия)подсчитываликоличествоклетоксморфологическими признаками митозов. Иммуноцитохимическое исследование фибробластоввыполняли по стандартной методике с использованием в качестве первичных антител МКА кKi-67 («Sigma», США) в разведении 1:20 и вторичных ФИТС-меченых козьих антител киммуноглобулинам мыши («Сорбент», Россия).

Полученные препараты изучали с помощьюлюминесцентногомикроскопа(Axiophot,«CarlZeiss»,Германия).Макрофагальнуютрансформацию моноцитов определяли по Демченко Т.А. (1980) путем 24-часовогокультивирования клеток с последующей окраской по Романовскому-Гимза и микроскопическойоценкой с определением в процентах количества макрофагов.Макроморфологическоеисследованиебрюшнойполостивключалооценкувыраженности спаечного процесса: его распространенность, локализацию спаек, их форму,деформацию органов спайками, наличие выпота. Материал для гистологических исследованийподвергали стандартной проводке для световой микроскопии с заливкой в парафин с окраскойсрезов гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону.Количество основного маркера коллагена оксипролина в супернатантах клеточныхкультур и перитонеальной жидкости определяли методом Шараева П.Н.