Автореферат (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 3

В фармакологических экспериментах установлена эффективность крема, проявляющаясяуменьшением площади рубцовой поверхности, изменением цвета рубца, исчезновениемболевых ощущений. Морфологически доказан факт более раннего структурного созреваниярубца кожибез гипертрофии.Верапамил укорачивал все фазы воспаления, усиливалрепаративные процессы, блокировал гипертрофию и приводил к преимущественномуформированию физиологических рубцов.9Методология и методы исследованияРеализована методология изучения фармакодинамической активности БМКК вотношении соединительной ткани и ее основных клеток - фибробластов: от формулировкирабочей гипотезы через внедрение адекватной экспериментальной модели и проведениеисследований in vivo и in vitro, до создания новой лекарственной формы антирубцового крема сверапамилом.Всесторонние доклинические испытания новых свойств БМКК на живых системахпроводились in vivo на целостном организме (447 животных - крысы, кролики) и in vitro на 720первичных культурах перитонеальных фибробластов и макрофагов и на 160 перевиваемыхкультурах дермальных фибробластов человека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производстваAxolBioscience).Проведеныфармакотехнологическиеисследованияпоразработкеоптимального состава антирубцового крема с верапамилом.Эксперименты выполнялись на 383 белых крысах самцах массой 200 – 240 граммов и64 кроликах самцах породы Шиншилла массой 2500 – 3200 граммов при строгом соблюдениитребований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу заподопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Впостановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных(WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. На первомэтапе экспериментов разрабатывался способ моделирования внутрибрюшинных спаек(гемоперитонеум) у крыс и кроликов (патент 2260854 РФ).На втором этапе проведено 6 серий экспериментов:1-я серия -in vivoисследовали морфологические характеристики пеританеальных спаек,биохимический состав и цитокиновый профиль перитонеальной жидкости на 7, 10 сутки послемоделирования гемоперитонеума у крыс;2-я серия - in vitro тестировали БМКК: верапамил, дилтиазем и нифедипин в разных дозовыхрежимах на первичных культурах перитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом;3-я серия -in vivo, после выявления в культуральном модуле препарата с наиболеевыраженнымфармакологическимэффектом(верапамил),оценилиегодействиенаформирование соединительной ткани в целостном организме крыс, определили режимдозированияверапамила,исходяизнеобходимостиминимизироватькардио-игемодинамические эффекты препарата;4-я серия -in vivo, для подтверждения универсальности разработанной моделиспайкообразования и идентичности действия верапамила у разных видов животных, проведены10эксперименты на кроликах с оценкой морфо-функциональных характеристик процессаспайкообразования;5 серия - in vitro, для выявления универсальности действия верапамила на разные типыфибробластов (перитонеальные фибробласты крысы и дермальные фибробласты человека)тестировали БМКК верапамил, дилтиазем и нифедипин на перевиваемой культуре дермальныхфибробластов человека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience).Полученный экспериментальный материал послужил основанием для создания новойлекарственнойформыверапамилагипертрофический/келоидный рубец –дляместноговоздействиянаформирующийсяантирубцового крема, содержащего 0,25% растворверапамила гидрохлорида, ланолин, вазелин, димексид (патент 2290919 РФ);6-я серия - in vivo, для оценки эффективности оригинального антирубцового крема, послемоделирования патологических рубцовкожи, на них дважды в день наносили крем сверапамилом и сравнивали с результатами аналогичного воздействия на рубцы основы кремабез верапамила.

Для подтверждения безопасности крема его втирали в неповрежденныйучасток кожи. Морфо-функциональные исследования проводили на 10, 30 и 60 сутки лечения.Для решения поставленных цели и задач использовались экспериментальныефармакологические, фармацевтические, культуральные, морфологические, биохимические,иммунологические, функциональные и статистические методы исследований.Положения, выносимые на защиту1.В основе спаечного процесса в брюшной полости крыс и кроликов примоделированиигемоперитонеума(патент2260854РФ)лежатмеханизмыактивациифибробластов с усилением их пролиферации, синтеза коллагена и гликозаминогликанов,активацией ядерного фактора транскрипции NF-κB, приводящей к блокированию апоптоза,ростом функциональной активности макрофагов и синтеза провоспалительных цитокинов TNF и IL-1.2.БМКК производные фенилалкиламина (верапамил) и бензотиазепина (дилтиазем) вкультурах активированных перитонеальных клеток и дермальных фибробластов оказываютвыраженный фармакологический эффект в отношении избыточной активности перитонеальныхфибробластов и макрофагов, ингибируя их пролиферативную активность, избыточнуюпродукцию компонентов межклеточного матрикса и цитокинов,угнетая экспрессиютранскрипционного ядерного фактора NF-kB перитонеальных и дермальных фибробластов.Эффективность верапамила в эквимолярных дозах вдвое выше.

Производные дигидропиридина(нифедипин) данных эффектов не проявляют.11Доза верапамила 0,1 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном введении не вызывает3.значимых изменений кардио- и гемодинамики и является оптимальной для профилактикиспайкообразования, тормозя избыточное разрастание соединительной ткани путем регуляцииактивности фибробластов и макрофагов, приводящей к снижению уровня белковосвязанногооксипролина, гиалуроновой кислоты, провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-1 вперитонеальной жидкости крыс и кроликов.Разработан оптимальный состав и технология оригинального антирубцового крема с4.верапамилом (патент 2900919 РФ). Соотношения лекарственного средства и вода-ланолинвазелиновой основы 3:6:1 обеспечивает оптимальную скорость и полноту высвобожденияверапамила из крема.

В опытах in vivo изучено антирубцовое действие крема при накожномнанесении и установлена его высокая специфическая активность, проявляющаяся уменьшениемплощадирубцовойповерхностистрансформациейпатологическихрубцовкоживфизиологические. Применение крема является безболезненным, безопасным.Степень достоверности результатовДостоверность полученных результатов обусловлена достаточным объемом (383 белыекрысы, 64 кролика, 880 культур клеток) и корректным формированием изучаемых выборок,широким спектром и высокой информативностью современных методов исследования,многоуровневым тестированием in vitro и in vivo, положительными решениями по результатампатентной экспертизы результатов исследования с выдачей патентов РФ на изобретения (№№2260854, 2900919), адекватностью статистической обработки полученных данных с помощьюпараметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических (критерий Манна-Уитни,Вилкоксона, χ2, критерий Колмогорова-Смирнова) методов анализа, публикациями результатовисследования в рецензируемых научных изданиях.

Количество экспериментальных животных вкаждой группе статистически обосновано по Lopez-Jimenez F. и достаточно для получениядостоверных результатов. Первичная документация проверена комиссией в соответствии сприказом ректора ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России № 57-у от 19 июня 2017 года.Апробация материалов диссертацииМатериалы и основные положения диссертации представлены на IX национальномконгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); Всемирном конгрессе по клинической ииммунной патологии (Сингапур, 2002); Межрегиональной научно-практической конференции«Современныенаправленияразвитиярегиональногоздравоохранения»(Омск,2005);Международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки,образования и производства» (Шимкент 2008); XLIII Всероссийской конференции «Актуальныепроблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень122009);II научно-практической конференции с международным участием «Достиженияклинической фармакологии в России» (Москва 2009); VI Дальневосточном региональномконгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток 2009); научнопрактической конференции «Фармацевтическая наука и практика: достижения и перспективы»(Кемерово 2009); LXV региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск2010); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2010); IIМеждународной конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий»(Казань 2011); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2012);V Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствованияфармацевтического образования.

Создание новых физиологически активных веществ»(Воронеж 2013); Всероссийской конференции c международным участием «Актуальныевопросы фармацевтики и фармацевтического образования в России» (Чебоксары 2013); XXVМеждународной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальныевопросы»(Новосибирск2013);Международнойнаучно-практическойконференции«Актуальные вопросы медицины XXI века» (Уфа, 2014); III Международной научнопрактическойконференции«Актуальныевопросымедицины»(Актобе,2014),IIМеждународной научно-практической конференции «Отечественная наука в эпоху изменений:постулатыпрошлогоитеорииновоговремени»(Екатеринбург,2014);заседанииМежвузовского Комитета по этике (г.Москва, протокол №03-16 от 17 марта 2016 года);расширенном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии, патофизиологии,клинической патофизиологии, факультетской терапии, госпитальной терапии, общей хирургии,анестезиологии и реаниматологии, общей химии ФГБОУ ВО «Омский государственныймедицинский университет» МЗ РФ (г.Омск, протокол № 2 от 27 июня 2017 года).ПубликацииПо теме диссертации опубликовано 23 научных работ, в том числе 21 – в журналах,рекомендуемых ВАК для докторских диссертаций, и 2 (патенты РФ на изобретения) к нимприравненных.