Диссертация (Воздействие высокодисперсного металлургического шлама на сельскохозяйственные растения), страница 9

Для осаждения полиамида приливали 2,4дм3 50%-ного этанола. Суспензию при энергичном помешивании разбавляли водой (0,8см3) и фильтровали на воронке Бюхнера. Осадок промывали три раза водой (по 3 дм 3каждый раз), а затем три раза раствором щелочи (30 г на 1 дм3). Далее отмывали осадок отщелочидонейтральнойреакции(пофенолфталеину),переносилиналистыфильтровальной бумаги и сушили при комнатной температуре.Ход определенияНавеску растительного материала массой 100-200 мг растирали в фарфоровойступке в присутствии полиамида (50-100 мг) и буферного раствора, переносили в мерную40колбу на 25 см3 и доводили буферным раствором до метки.

Центрифугировали при 4000об/мин в течение 10 мин.В контрольную кювету вносили 0,5 см3 ферментной вытяжки, 2,0 см3 фосфатногобуфера с рН 7,4 и 0,5 см3 Н2О.В опытную кювету спектрофотометра вносили 0,5 см3 ферментной вытяжки, 2,0см3 фосфатного буфера с рН 7,4 и 0,5 см3 раствора пирокатехина.Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ 2000 при 420 нм сшагом 2 с в течение 120 с.Расчет активности полифенолоксидазыРасчет активности полифенолоксидазы в относительных единицах на один граммсухого веса проводили по формуле:A = (ΔD•V•X)/(T•L•m•Δm), где:А – активность фермента,ΔD – изменение оптической плотности (вычитали из оптической плотности вначале реакции оптическую плотность в конечный момент времени),V – общий объём полученной вытяжки, мл,X – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси делили наколичество вносимого экстракта),T – время реакции, с,L – толщина слоя, см,m – масса навески, г,Δm – отношение сухого веса к сырому.Для определения активности фермента на 1 мг белка использовали следующуюформулу:A = ((ΔD/T)Х)/(L•С), где:А – активность фермента,ΔD – изменение оптической плотности (вычитали из оптической плотности вначале реакции оптическую плотность в конечный момент времени),X – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси делили наколичество вносимого экстракта),T – время реакции, с,L – толщина слоя, мм,С – содержание белка в пробе, мг.2.3.4.3 Определение активности каталазы41Для определения активности каталазы использовали спектрофотометрическийметод, основанный на определении скорости разложения перекиси водорода каталазойисследуемого образца с образованием воды и кислорода (Aeby, 1984).РеактивыДигидроортофосфаткалия,фосфорнаякислота,гидроксиднатрия,фенилметилсульфонилфторид, пероксид водорода, ацетон, хромовая смесь, водадистиллированная.Приготовление растворов и смесей реагентов1) 50 мМ K,Na–фосфатный буфер (рН 7,8).2) 50 мМ K,Na–фосфатный буфер (рН 7,0).Буферы готовили из следующих сток–растворов:0,2 М КН2РО4 (1,36 г КН2РО4 растворяли и доводили до 50 мл).0,2 М NaOH (400 мг NaOH растворяли доводили до 50 мл).Приготовление 50 мМ K,Na–фосфатного буфера, рН 7,8:25 мл 0,2 М КН2РО4 и 22,25 мл 0,2 М NaOH смешивали и доводили до 100 млдистиллированной водой.

рН раствора корректировали с помощью концентрированнойH3PO4 или 5% NaOH.Приготовление 50 мМ K,Na–фосфатного буфера, рН 7,0:25 мл 0,2 М КН2РО4 и 14,55 мл 0,2 М NaOH смешивали и доводили до 100 млдистиллированной водой.3) экстракционный буфер (к 2 мл 50 мМ K,Na–фосфатного буфера (рН 7,8)добавляли 20 мкл раствора 100 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ)).4) 0,6 М перекись водорода (3 мл 3% перекиси водорода доводили до 4,5 млдистиллированной водой).Ход определенияНавеску растительной ткани массой 250 мг растирали в охлажденной ступке в 0,5мл экстракционного буфера. Гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 12 000 g.Пробы хранили в холодильнике (4 °С).Реакционная смесь содержит:2,95 мл 50 мМ K,Na–фосфатного буфера (рН 7,0)30 мкл экстрактаРеакция запускается внесением в реакционную смесь 20 мкл 0,6 М перекисиводорода.

Контрольная кювета содержит те же реактивы, но в нее не вносится перекисьводорода.42Активность каталазы определяли по изменению оптической плотности при длиневолны 240 нм ежесекундно в течение 120 с.Расчет активности каталазыРасчет активности каталазы в относительных единицах на один грамм сухого весапроводился по формуле:A = (ΔD•V•X)/(T•L•m•Δm), где:А – активность фермента,ΔD – изменение оптической плотности (вычитали из оптической плотности вначале реакции оптическую плотность в конечный момент времени),V – общий объём полученной вытяжки, мл,X – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси делили наколичество вносимого экстракта),T – время реакции, с,L – толщина слоя, см,m – масса навески, г,Δm – отношение сухого веса к сырому.Для определения активности фермента на 1 мг белка использовали следующуюформулу:A = ((ΔD/T)Х)/(L•С), где:А – активность фермента,ΔD – изменение оптической плотности (вычитали из оптической плотности вначале реакции оптическую плотность в конечный момент времени),X – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси делили наколичество вносимого экстракта),T – время реакции, с,L – толщина слоя, мм,С – содержание белка в пробе, мг2.3.4.4 Определение активности растворимой пероксидазыАктивностьпероксидазыопределялиспектрофотометрическимметодом,основанным на определении скорости реакции окисления бензидина до образованиясинего продукта его окисления в присутствии перекиси водорода и пероксидазы.РеактивыАцетат натрия, уксусная кислота, гидроксид натрия, фенилметилсульфонилфторид,пероксидводорода,спиртизопропиловый,ацетон,хромоваясмесь,водадистиллированная.43Приготовление растворов и смесей реагентов1) 0,2 М Na–ацетатный буфер (рН 5,0).

Его готовили из следующихконцентрированных растворов (сток–растворов):0,2 М CH3COOH (2,4 мл CH3COOH доводили до 200 мл дистиллированной водой),0,2 М CH3COONa (5,44 г CH3COONa доводили до 200 мл дистиллированнойводой).Для приготовления 100 мл раствора смешивали 30 мл 0,2 М раствора CH3COOH и70 мл 0,2 М раствора CH3COONa. рН буфера корректировали с помощью CH3COOH и 5%NaOH.Перед использованием в ацетатный буфер добавляли фенилметилсульфонилфторид(ФМСФ) из расчета 20 мкл 100 мМ раствора ФМСФ на 2 мл буфера (34 мг ФМСФрастворяли в 2 мл изопропилового спирта).2) 0,01% раствор солянокислого бензидина (на 10 проб: 5,6 мг бензидинарастворяли в 1 мл концентрированной уксусной кислоты и доводили до 6 млдистиллированной водой).3) 0,3% перекись водорода (0,5 мл 3% перекиси водорода довести до 5 млдистиллированной водой).Ход определенияНавеску растительной ткани массой 200–300 мг растирали в холодной фарфоровойступке холодным пестиком с 0,5 мл ацетатного буфера (рН 5,0).

Полученный гомогенатцентрифугировали в течение 5 мин при 12 000 g. Пробы хранили в холодильнике при 4°С.Реакционная смесь содержит:0,98 мл 0,2М Na–ацетатного буфера (рН 5,0)0,5 мл 0,01% раствора солянокислого бензидина0,02 мл экстракта0,5 мл 0,3% перекиси водородаКонтрольная кювета содержит:1,48 мл 0,2 М Na–ацетатного буфера (рН 5,0)0,5 мл 0,01% раствора солянокислого бензидина0,02 мл экстрактаИзмерение оптической плотности проводили при длине волны 590 нм ежесекунднов течение 120 с.После проведения опыта кюветы помещали в хромовую смесь на 30 минут, затеммыли дистиллированной водой и сушили ацетоном.Расчет активности растворимой пероксидазы44Расчет активности пероксидазы в относительных единицах на один грамм сухоговеса проводили по формуле:A = (ΔD•V•X)/(T•L•m•Δm), где:А – активность фермента,ΔD – изменение оптической плотности (вычитали из оптической плотности в концереакции оптическую плотность в начальный момент времени),V – общий объём полученной вытяжки, млX – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси делили наколичество вносимого экстракта),T – время реакции, с,L – толщина слоя, см,m – масса навески, г,Δm – отношение сухого веса к сырому.Для определения активности фермента на мг белка использовали следующуюформулу:A = ((ΔD/T)•X)/(L•С),где:А – активность фермента,ΔD – изменение оптической плотности (вычитали из оптической плотности в концереакции оптическую плотность в начальный момент времени),X – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси делили наколичество вносимого экстракта),T – время реакции, с,L – толщина слоя, см,С – содержание белка в пробе, мг.2.3.4.5 Определение концентрации хлорофилла а и b и каротиноидовРеактивы100%–ный ацетон, хромовая смесь, вода дистиллированная, промытый ипрокаленный песок.Ход определенияНавеску растительного материала массой 0,1 г растирали в фарфоровой ступке сдобавлением песка, последовательно смачивая небольшими порциями 100%–ногоацетона.

Каждую порцию растворителя сливали в мерную колбу объемом 25 мл.Последней была порция обесцвеченного ацетона. Объединенные порции экстрактадоводили в колбе растворителем до метки. Во избежание возможных потерь пигментов45стенки применяемой для гомогенизации и экстракции посуды тщательно промывали100%–ным ацетоном.Центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин.Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ 2000 при длинах волн:хлорофилл а – 662 нм, хлорофилл b – 644 нм, каротиноиды – 440,5 нм.Контрольная проба – 100%–ный ацетон.Расчет концентрации хлорофилла а и b и каротиноидовРасчет содержания пигментов в навеске растительного материала проводили поформулам:Са = 11,7D662–2,09D644,Сb = 21,19D644–4,56D662,Са+b = 7,14D644+19,1D662,Ск = 4,695D440,5 – 0,268Са+b,Са – концентрация хлорофилла а, мг/л;Сb – концентрация хлорофилла b, мг/л;Са+b – суммарная концентрация хлорофиллов а и b, мг/л;Ск – общая концентрация каротиноидов, мг/л;D662 – оптическая плотность раствора при длине волны 662 нм;D644 – оптическая плотность раствора при длине волны 644 нм;D440,5 – оптическая плотность раствора при длине волны 440,5 нм.Измерение активности ферментов и концентрации пигментов проводили в трёханалитических повторностях.

Стандартную ошибку вычисляли в программе MicrosoftOffice Excel (опция «Описательная статистика»).2.3.5 Методика проведения полевых исследованийПолевые исследования проводились согласно методикам Доспехова Б.А. (1985).Место проведения исследований – агробиостанция Социально-педагогического институтаФГБОУ ВО «МичГАУ».Климат Мичуринского района Тамбовской области умеренно-континентальный степлым солнечным летом и морозной зимой с устойчивым снежным покровом. Периодактивной вегетации начинается во второй половине апреля и продолжается 140-180 дней собщей суммой активных температур 2300-2450°С, что является достаточным длясозревания основных сельскохозяйственных культур. Безморозный период длится около145 дней.