Автореферат (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 4

rhamnosus GG).Количество гормона пролактина в крови крыс, получавших штамм L. plantarum 90sk, былодостоверно ниже, чем у крыс получавщих стерильную среду MRS и штамм L. rhamnosus GG.Увеличение содержания ГАМК в крови крыс опытной группы свидетельствует о том, чтоштамм L. plantarum 90sk синтезировал в кишечнике ГАМК, которая затем попадала вкровяное русло. Снижение уровня пролактина у крыс опытной группы говорит о том, чтоданный штамм, введённый в кишечник животных, влиял на содержание пролактина в кровии, возможно, увеличивал адаптацию крыс к холодовому стрессу (рис.

6).Оптимизация условий опытов по изучению влияния нейротрансмиттеров на ростлактобациллДля исследования влияния на рост лактобацилл и бифидобактерий были выбраны 3нейротрансмиттера, относящихся к семейству катехоламинов (норадреналин, адреналин идофамин), продукция которых организмом человека значительно увеличивается в стрессовыхусловиях. Действие серотонина на рост бактерий мы рассматривали как контроль, так каксеротонин присутствует постоянно в кишечнике и не связан с реакцией организма на стресс.Опыты по оптимизации условийпроведены со штаммом L.plantarum 90sk.Выращивание штамма L.

plantarum 90sk в среде MRS с норадреналином и дофамином неприводило ни к стимуляции, ни к ингибированию роста. Поэтому мы выбрали другуюпитательную среду – SAPI – на основе сыворотки крови крупного рогатого скота, которуюранее использовали в аналогичных опытах с другими бактериями.Были установлены оптимальные концентрации норадреналина (100 мкМ), исходнаяконцентрация бактериальных клеток, необходимая для проявления эффекта (10 2 КОЕ/мл) и16длительность выращивания культуры (48-72 часа). В данных условиях бактериальнаякультура либо не росла совсем, либо росла плохо. Добавление катехоламинов и серотонинапозволяло культуре расти или усиливало рост (культура формировала большее число КОЕ/млза тот же промежуток времени).Изучение влияния норадреналина, адреналина, дофамина и серотонина на ростразличных штаммов лактобацилл и бифидобактерийЦелью изучения влияния нейротрансмиттеров на рост различных штаммовлактобацилл и бифидобактерий являлось установление реакции штаммов на присутствиеэтих веществ (стимуляция/ингибирование) и определение отличий между штаммами однойвидовой группы.Таблица 5.

Влияние катехоламинов и серотонина на рост штаммов 10 видов бактерий.Lactobacillus fermentumLactobacillusrhamnosusLactobacillus plantarumВид бактерийL. brevisL. buchneriШтаммНорадреналинАдреналинДофаминСеротонин90skk-1329st36st46k29sk43/23/156/142/257/150/214/446/97/119А52/138/1GG242gn22gn51gn31647130850zv26sk11625112sk103sk279NB-22347439253291369U-21102sk108sk31133915st47st364+++Н/ВН/ВН/ВН/В++++++++++++Н/В+++++++++++++++++Н/В++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++Н/В+++Н/В++++Н/В+Н/В++Н/ВН/В+Н/В+++++++++Н/В++++++Н/В+++++++++++++Н/ВН/В++++++++++++++Н/В+++Н/В++++++Н/В+Н/В++++Н/ВН/В++Н/ВН/ВН/ВН/В+++++++Н/В++++++++++Н/В+++++++++++++++++++++++++++Н/ВН/В+++Н/В++Н/ВН/В+Н/В+++Н/В381-1Н/ВН/ВН/ВН/ВН/ВН/В+Н/В+Н/В+Н/ВН/ВН/ВН/В+Н/В++Н/ВН/В++Н/ВН/ВН/В+++Н/В++++Н/В++++Н/ВН/ВН/ВН/ВН/ВН/В+++Н/ВН/В+Н/В++Н/ВН/ВН/В17Вид бактерийL.

caseiL. helveticusL. salivariusB. adolescentisШтаммНорадреналинАдреналинДофаминСеротонин42st48st131NNIE100H31544st64sk321Km-448150GT102Н/ВН/В++Н/ВН/В+++++++++Н/В++++Н/В+Н/ВН/В++Н/ВН/В+++Н/ВН/ВН/В++++Н/В+Н/ВН/В++Н/ВН/В+++++++++Н/В++++Н/В+Н/ВН/В+++Н/ВН/В++0++Н/В++++Н/В+B. angulatumПримечание. + - увеличение на один порядок; ++ - увеличение на два порядка; +++ увеличение на три порядка; ++++ - увеличение на четыре порядка. Н/В - нет влияния.Изучив влияние катехоламинов и серотонина на рост штаммов лактобацилл, можносделать главный вывод – катехоламины и серотонин влияют на рост лактобацилл ибифидобактерий. Из 61 проверенного штамма 48 усиливали рост в присутствии хотя быодного из нейротрансмиттеров.

Влияние штаммоспецифично, т.е. разные штаммы в пределаходной видовой группы по-разному реагировали на присутствие катехоламинов (табл. 5).Изучение влияния норадреналина на транскрипционную активность генов L. plantarum90sk в среде SAPI методом ПЦР в реальном времениНами было изучено влияние норадреналина на транскрипционную активность рядагенов у штамма L.

plantarum 90sk. Были выбраны гены, вовлечённые в процессы,потенциально стимулируемые норадреналином. Это гены транспорта железа (feoA, feoB),гены антиоксидантной активности (trxB) и гены адгезии (mub, сcpA). Гены feoA и feoB,кодируют белки, транспортирующие ионы железа внутрь клетки. Ген trxB кодирует синтезтиоредоксина. Ген mub кодирует белок – фактор адгезии к слизистой оболочке. CcpA являетсябелком, ингибирующим транскрипцию катаболитных генов. Его активность считается однимиз маркеров образования биопленок.Относительнаяэкспрессия2-ΔΔCT2,521,510,50контрольfeoAfeoBmubtrxBГеныРисунок 7.

Экспрессия генов штамма L. plantarum 90sk в присутствии норадреналинаотносительно гена recA. На графике изображена относительная экспрессия, пересчитаннаяметодом ΔΔCT.18Норадреналин достоверно стимулировал транскрипционную активность генов,участвующих в транспорте железа (feoA, feoB), антиоксидантной активности (trxB) иадгезии (mub) у штамма L. plantarum 90sk (рис. 7). Влияния норадреналина натранскрипционную активность гена ccpA не было. Таким образом, норадреналин не простоувеличивал рост штаммов лактобацилл и бифидобактерий, а влиял на экспрессию генов, ивероятно,важныефизиологическиепроцессыклеток–метаболизмжелеза,антиоксидантные свойства, адгезию.ЗАКЛЮЧЕНИЕВ нашей работе были исследованы штаммы лактобацилл и бифидобактерий (141 водной части работы и 61 – в другой).

Показано, что часть этих штаммов способнасинтезировать и секретировать в среду ГАМК. Это свойство оказалось видоспецифичным ибыло присуще всем нашим штаммам видов L. plantarum, L. brevis, B. adolescentis, B.angulatum, B. dentium. Более 80% проверенных штаммов реагировали усилением роста (в 10104 раз по числу КОЕ/мл) на присутствие в среде катехоламинов и серотонина. Даннаяособенность была штаммоспецифичной.

Результаты опытов по введению штамма-продуцентаГАМК животным, находящимся в условиях стресса, показали, что в крови животныхувеличивалось количество ГАМК и уменьшалось – гормона пролактина. Полученныерезультаты свидетельствуют о том, что ГАМК, катехоламины и серотонин участвуют вкоммуникации бактерий-симбионтов (лактобацилл и бифидобактерий) с организмомчеловека.

Способность синтезировать ГАМК, активация роста микроорганизмов итранскрипции ряда генов под действием катехоламинов и серотонина являются важнымисвойствамибактерийпробиотическихи,штаммов.по-видимому,Полученымогутданные,бытьиспользованыуказывающиенаприселекцииадаптивнуюрольисследованных штаммов лактобацилл и бифидобактерий, продуцирующих ГАМК, дляорганизма хозяина.19ВЫВОДЫ1) Из вагинального содержимого микробиоты человека выделены и идентифицированыштаммы L. salivarius, L. crispatus; из фекалиий – штаммы L. casei, L. buchneri, L.

johnsoniiL. gasseri; из слюны – штаммы L. casei, L. plantarum. Во всех трех изученных биотопахдоминировали виды L. rhamnosus и L. fermentum.2) Большинству исследованных штаммов лактобацилл и бифидобактерий (58 из 141 штамма17 видов) присуща видоспецифическая особенность (L. plantarum, L. brevis, B. angulatum,B. adolescentis и B.

dentium) синтезировать и секретировать в среду ГАМК (до 5,6 г/л).Добавление кофактора PLP (на поздней стационарной фазе роста) увеличивалопродукцию ГАМК в 4 раза у штамма L. plantarum 90sk и не влияло на ее синтез у штаммовL. brevis 15f, B. angulatum GT102 и B. adolescentis 150.3) У штаммов L. plantarum 90sk, L. brevis 15f, B. angulatum GT102, B. adolescentis 150идентифицированы гены gadB (глютаматдекарбоксилазы) и gadC (глутамат/ГАМКантипортера).

В белках GadB и GadC штаммов L. plantarum 90sk, L. brevis 15f, B.angulatum GT102 найдены уникальные аминокислотные замены, свидетельствующие оботличиибелков/геновотидентифицированныхранеегомологов.УштаммаL. plantarum 90sk гены gadB и gadC максимально экспрессировались в стационарной фазероста. Понижение pH среды до 3,5 и 5,0 индуцировало транскрипционную активностьданных генов.4) Катехоламины (дофамин, норадреналин, адреналин) и серотонин в солевой среде ссывороткой крови на 1-4 порядка усиливают рост 30 из 61 проверенных штаммовлактобацилл и бифидобактерий. Штамм L.plantarum 90sk реагирует на присутствиенорадреналина активацией транскрипции ряда генов (feoA, feoB, trxB, mub).5) При введении этого штамма крысам линии Спрэг-Доули в условиях холодового шокаповышается уровень ГАМК и понижается уровень гормона пролактина в крови.20СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1) Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus и Bifidobacterium по их способностисинтезировать гамма-аминомасляную кислоту – один из подходов в получениипсихобиотиков / Р.А.

Юнес, Е.У. Полуэктова, М.С. Дьячкова, Ю.Е. Козловский, В.С.Орлова, В.Н. Даниленко // Вестник Российского университета дружбы народов.Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. 2016. - № 4 – С. 51-59.2) Патент 257625 РФ. Шаммы Lactobacillus plantarum и Lactobacillus brevis, синтезирующиегамма-аминомасляную кислоту / В.Н. Даниленко, Р.А.

Юнес, Е.У. Полуэктова // Бюл. 2016 - №5 – С. 21.3) Draft genome sequences of Lactobacillus plantarum strain 90sk and Lactobacillus brevis strain15f: focusing on neurotransmitter genes / R.A. Yunes, K.M. Klimina, K.V. Emelyanov, N.Z.Zakharevich // Genome Announc. – 2015. – Vol. 3. - № 2. – e00261-15.Публикации в сборниках конференций1) Разработка препаратов психобиотиков, направленных на снятие депрессивных состояний,вызываемых длительными стрессами / E.Y. Полуэктова, Р.А.