Автореферат (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 2

(Будапешт, 2015г.); семинаре фонда перспективных исследований по определениюприоритетных направлений исследований и разработке новых технологий ускореннойадаптации человека к неблагоприятным климатогеографическим условиям Арктики (Москва,2016); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии иклинической микологии (XIX Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2016).ПубликацииАвтором опубликованы 5 печатных работ по теме диссертационной работы; их них 2 вжурналах,входящихвпереченьрецензируемыхнаучныхжурналовиизданий,рекомендованных ВАК Минобрнауки.Структура и объём диссертацииДиссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалови методов исследования, результатов и обсуждения, а также заключения, выводов, спискацитируемой литературы и приложений.

Работа изложена на 155 страницах машинописноготекста, включает 19 таблиц, 34 рисунка, 1 приложение. Список цитируемых литературныхисточников включает 276 наименований.Личный вклад автораАвтор принимал личное участие на всех этапах выполнения работы: в планировании иосуществлении экспериментов, оценке и интерпретации их результатов, составлениилитературного обзора. В процессе исследования непосредственно автором осуществлялосьвыделение ДНК и РНК; конструирование праймеров, проведение ПЦР и электрофореза вагарозномгеле;анализнуклеотидныхпоследовательностей;проведениеобратнойтранскрипции и количественной ПЦР-РВ.

Работа по идентификации гамма-аминомаслянойкислоты в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографиибыла проведена в Институте биоорганической химии имени Ю.А. Овчиникова и М.М.Шемякина РАН под руководством Ю.С. Скоблова. Работа по изучению влиянияпробиотических штаммов на животных выполнена в Институте морфологии человека РАМНпод руководством Ю.Е.

Козловского. Cеквенирование ДНК штаммов проведено совместно сК.М. Климиной на платформе Roche 454 в Институте общей генетики имени Н.И. ВавиловаРАН в лаборатории генетики микроорганизмов. Скриниг штаммов бифидобактерийосуществляли совместно с сотрудником ИОГен РАН Дьячковой М.С. Автор лично проводил6статистическую обработку полученных данных, оформлял результаты для представления ввиде тезисов и докладов на научных конференциях, а также принимал участие в написаниистатей по результатам экспериментов. В работах, выполненных в соавторстве, использованыматериалы исследований с долей личного участия автора 75-95%.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВ разделе "Обзор литературы" изложены литературные данные о микробиотечеловека; бактериях рода Lactobacillus и Bifidobacterium; гамма-аминомасляной кислоте и еёроли в кишечнике; катехоламинах и серотонине и их влиянии на метаболизм бактерий.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫШтаммы бактерий, использованные в работеВ работе был исследован 141 штамм лактобацилл и бифидобактерий, выделенных изразличных биотопов организма россиян (кишечник, ротовая полость, влагалище) заисключением 15 штаммов, выделенных из организма жителей Казахстана.

Подавляющеебольшинство штаммов были выделены на кафедре микробиологии и вирусологии с курсомиммунологии в Тверском государственном медицинском университете. Также использовалинесколько типовых штаммов из коллекций ATCC, ГКНМ.Среды и условия ростаЛактобациллы культивировали в среде MRS (HiMedia, Индия; deMan et al., 1960).Бифидобактерии выращивали в среде MRS с добавлением 0,05% цистеина. Для проверкиспособности штаммов к синтезу ГАМК добавляли в питательную среду 1% предшественникаГАМК – мононатриевой соли глютаминовой кислоты. Опыты с катехоламинами исеротонином проводили в минимальной среде SAPI (Freestone et al., 2000). Перед тем какиспользовать штамм, его реактивировали по следующей схеме: замороженная культура(-80°C) → чашки со средой MRS (48 часов) → жидкая среда MRS (24 часа) → 1:100 жидкаякультура (рабочая культура). Подсчёт колониеобразующих единиц производили методомсерийных разведений в 0,82% растворе NaCl с последующим высевом на агаризованнуюсреду MRS.Использованные в работе животныеОпыты на животных проводили на крысах-самцах линии Спрэг-Доули.

Крысыполучены из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН, Пущино.Молекулярно-генетические методыВ работе применяли следующие молекулярно-генетические методы: выделение ДНК,конструированиепраймеровипроведениеполимеразнойцепнойреакции(ПЦР),электрофорез ДНК в агарозном геле, секвенирование ДНК, выделение тотальной РНК,проведение обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции в7режиме реального времени (ПЦР-РВ). Праймеры конструировали с помощью программыNCBI/Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) и синтезировали в фирме“Синтол” (Россия). Секвенирование ДНК штаммов было проведено в ИОГен на платформеRoche 434.Биохимические методыДля разделения аминокислот и идентификации ГАМК в культуральной жидкостиисследуемых штаммов использовали тонкослойную хроматографию на стеклянных пластинахс тонким закреплённым слоём силикагеля (TLC plates 10*20 cm Silicagel 60 F254 Merck).

ДляидентификацииГАМКтакжеиспользоваливысокоэффективнуюжидкостнуюхроматографию как более чувствительный метод.Статистические методыСтатистическая обработка результатов проведена с использованием критерияСтьюдента t для 95% доверительного интервала колебаний средней арифметической.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕОтбор штаммов лактобацилл и бифидобактерий, синтезирующих и выделяющихв среду гамма-аминомасляную кислотуДля отбора штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезу ГАМК,была проверена коллекция лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН из 116штаммов 14 видов лактобацилл и 25 штаммов 3 видов бифидобактерий; штаммы быливыделены из микробиоты жителей центрального региона России (Табл.

1). Всего былпроверен 141 штамм.Скрининг проводили методом тонкослойной хроматографии культуральной жидкостиштаммов, выращенных в среде MRS с предшественником ГАМК – глутаматом натрия.Таблица 1. Скрининг штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезу ГАМК.Вид бактерийLactobacillus fermentumLactobacillus rhamnosusLactobacillus plantarumLactobacillus brevisLactobacillus caseiLactobacillus helveticusLactobacillus salivariusLactobacillus sakeiLactobacillus reuteriLactobacillus mucosaLactobacillus crispatusLactobacillus buchneriLactobacillus gasseriLactobacillus delbrueckiiBifidobacterium adolescentisBifidobacterium angulatumBifidobacterium dentiumВсегоКоличество проверенных штаммов2428303122413123122131141Количество штаммов-продуцентов ГАМК0030300000000002131588Способность синтезировать и секретировать в среду ГАМК обнаружилась у 58штаммов; эта способность, по нашим данным, видоспецифична и обнаружена у всехпроверенных штаммов видов L.

plantarum (30 штаммов), L. brevis (3 штамма), B. adolescentis(21 штамм), B. angulatum (3 штамма), B. dentium (1). Штаммы видов L. fermentum,L. rhamnosus, L. casei, L. helveticus, L. salivarius, L. salvei, L. mucosa, L. crispatus, L. gasseri,L. debrueckii, L. reuteri, L. buchneri ГАМК не синтезировали. По литературным данным,отдельные штаммы видов L. buchneri, L. casei, L. delbrueckii (Dhakul et al., 2012) синтезируютГАМК.

Вероятно, подобные штаммы являются результатом горизонтального переноса генов,контролирующих синтез ГАМК.Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами и бифидобактериямиКоличество синтезируемой ГАМК в культуральной жидкости определяли методомдвумерного сканирования хроматографических пластинок. Результаты представлены втаблице 2.Таблица 2. Способность штаммов лактобацилл и бифидобактерий синтезировать ГАМК.Штаммы119 sk106 zv8-PA-390 sk29sk46sk75sk32skK9LCS39636st29st46k191g50st 3K1343/543/443/343/2Продукция ГАМК, мкг/млLactobacillus plantarum993610521025762191847874306110133871817618592101ПродукцияГАМК,мкг/мл42/212038/14719/1A3214/4277/1683/16657/114956/110452/16850/213Lactobacillus brevis47st10052st5015f675Bifidobacterium adolescentis56195730237685044230244-22966483090ШтаммыШтаммыПродукция ГАМК,мкг/мл48-2205210891617423415056111102130152501627728871047821912572821489Km42765Km5-14942S142333S11854Tv29441Bifidobacterium angulatum1023469334-126162123214Bifidobacterium dentium92465Примечание: лактобациллы выращивали 3 суток, бифидобактерии – 2 суток.Способность к синтезу ГАМК варьировала в пределах одного вида и былаотносительно низкой для лактобацилл; у штаммов вида L.