Автореферат (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 2

Пластик и расходные материалы использовали одноразовый. Посуду из стекла использовали только для кратковременного хранения растворов и воды для разведения. Для экспериментов in vivo использовали белых лабораторных крыс Wistar из разведения питомникаФИБХ РАН (МО, г. Пущино-на-Оке). Для оценки статистически значимых различий использовали данные, полученные в сериях экспериментов. Оценку проводили после определения типа распределения данных ииспользовали непараметрические критерии сравнения как парных зависимых, так и парных независимых выборок.Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодных сессиях ЦНИИГастроэнтерологиии ГБУЗ МКНЦ ДЗМ: 41-я Научная сессия ЦНИИГ; XXXIX сессияЦНИИ гастроэнтерологии "Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» 2012 г.; «Расширяя границы» 5-6 марта2015 г.; «Принципы доказательной медицины в клиническую практику» 2-3 марта 2016 года; на расширенном заседании кафедры общейпатологии и патологической физиологии РУДН с привлечением сотрудников ГБУЗ МКНЦ ДЗМ.Публикации.

По материалам диссертации опубликовано16 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень, утвержденный ВАК Министерства образования и науки РФ.Объем и структура диссертации.Диссертация построена по традиционному принципу и включаетразделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результатыи их обсуждение, заключение и выводы. Материалы изложены на 146листах машинописного текста, содержат 25 рисунков и 22 таблицы.Библиографический список включает 197 работ.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯИсследование было разделено на два этапа: in vitro и in vivo. In vitro– Ах вносили непосредственно в среду с опухолевыми клетками (ОК).In vivo – были осуществлены модификации моделей и изучение патофизиологических эффектов Ах.

Общий вид исследования представленна рис. 1.6Р и с . 1. Общий дизайн-исследованияЭтап исследования in vitro включал в себя: отбор линий ОК, создание криобанка, стандартные методы работы с культурами эукариот:МТТ-метод, CSV, колониеобразование, тест заживления раны, проточную цитометрию. Последовательно определяли рабочие концентрацииАх и его эффекты, оказываемые на ОК.

Уточненная схема исследования in vitro представлена на рис. 2. После определения действия Ах вкультуре ОК переходили к исследованию его действия in vivo (рис. 3).Исследование состояло из 3 блоков: 1) оптимизация методов индукцииязвенного поражения слизистой оболочки толстой кишки (СОТК), определения концентрации Ах в биологических образцах и морфологическое уточнение степени повреждения; 2) модификация модели канцерогенного воздействия 1,2-азоксиметаном (АОМ); 3) исследование степени реактивности системы матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов(ММР-3 и ММР-9) и эпидермального фактора роста (EGF) в ответ наповреждение тканей (рис.

3). Группы животных: 1 – «интактные»,2 – «язва», 3 – «АОМ»; 4 – «язва+АОМ». Для оценки статистическизначимых различий (p<0,05) использовали данные, полученные в сериях экспериментов; оценку проводили после определения типа распределения данных, использовали непараметрические критерии сравнениякак парных зависимых, так и независимых выборок.7Р и с . 2. Схема исследования in vitroР и с . 3. Схема исследования in vivo8РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ АЦЕТИЛХОЛИНА ДЛЯ РАБОТЫIN VITRO.

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ EGF, ММР-3 И ММР-9Методом МТТ на ОК SW620 были определены нецитотоксическиеконцентрации Ах, время инкубации и степень изменения параметровжизнедеятельности ОК. Оптимальный диапазон рабочих концентрацийАх составил 10-6–10-4 М, время экспозиции 72 часа. Дальнейшая оценка эффектов проводилась стандартными методами определения скорости колониеобразования, выхода в монослой и CVS.

Анализ колониеобразования показал, что во всех исследованных концентрациях Ахоказывает слабое стимулирующее действие на ОК: увеличивается количество ОК к 72 часам при концентрации 10 -4 М (табл. 1). Далее дляуточнения скорости выхода ОК в монослой определили сокращениевремени образования монослоя при внесении Ах 10-4 М/лунку и менее.Таблица 1Тест изменения скорости удвоения, образования колонийВремя,часы72Кон.конц-ияАх, МСр.

кол-во колоний нач. Петри, шт.Среднее кол-во клеток вшарообразных образованиях, шт.033,616,410-32-34,818,210-43022,8-53017,810-63017,9043,616,410-334,822,010-440-120,810-54021,010-64021,21096Кол-во полныхудвоений клетки,разПри определении скорости зарастания дефекта монослоя былиполучены дозо- и времязависимые эффекты, которые выражались вувеличении количества ОК в области созданного деффекта. Данныемикрофотографий представлены на рис. 4. Результаты CVS-методасвидетельствовали, что при концентрации Ах 10-6М существуетстатистически значимое увеличение процента пролиферирующих ОК(Kruskal-Wallis test: p = 0,01). Этот эффект имел динамическую характеристику и усиливался к 72-му часу инкубации. Полученные данные9позволили предположить, что происходит стимуляция роста ОК черезсистему собственных ростовых факторов, в частности, эпидермального фактора роста (EGF), а также белков-регуляторов межклеточныхвзаимодействий – ММР-3 и ММР-9, связанных с этой системой.Секрецию EGF определяли ИФА-методом в супернатантах и клеточных лизатах.

При внесении Ах в лунки увеличение концентрацииEGF было обратно пропорционально количеству Ах, с которым инкубировали клетки (табл. 2).72 часа с АхУвеличение 20Увеличение 400МАх 10-6 МАх 10-4МР и с . 4. Скратч-тест. Фотографии состояния монослоя после егоразрушения и внесения Ах, 72 часа инкубации, увеличение ×20 и ×40Таблица 2Концентрация EGF в среде культивирования и клеточном лизатепосле инкубации клеток с Ах в течение 72 часовКонцентрация EGF, нг/млКон. конц-ия Ах, МСреда, n=12Лизат, n=9Ме (25;75)%Ме (25;75)%13,9 (10,1; 17,8)02,7 (2,0; 3,5)10-41,8 (1,1; 2,6)6,8 (4,1; 9,5)10-53,4 (2,7; 4,1)14,5 (6,3; 22,6)10-63,8 (3,2; 4,3)21,4 (12,5; 30,1)10Далее определяли концентрацию ММР-3 и ММР-9 (табл.

3). Показано, что в базальных условиях культивирования ОК к 96-му часу статистически значимо увеличивается количество ММР-3 в среде, одновременно снижается концентрация ММР-9 до 0 нг/мл. При добавленииАх 10-5М/лунку происходило увеличение концентрации ММР-3 в среде, в то время как в лизате изменений не определяли.

Эти эффектысвязаны с увеличением количества ОК, продуцирующих EGF и стимулирующих рост in vitro.Таблица 3Количество ММР-3 и ММР-9 в разных биологических субстратахчерез 72 и 96 часов инкубации с АхКонцентрация матриксных металлопротеиназ в среде культивирования, нг/млММР-3ММР-9Кон.конц-ия Ах,72 ч, n=996 ч, n=972 ч, n=996 ч, n=12ММе (25;75)%Ме (25;75)%Ме (25;75)%Ме (25;75)%00 (0; 0)0,1 (0,02;0,1)2,7*(2,3;3,7)0,0◊ (0;0)10-40 (0; 0)3,3 (3,3;6,1)0,0 (0,0; 0,1)0 (0; 0)10-56,6 (0; 11,4)0,0 (0,0; 0,0)0,04 (0,0; 0,1)14,1#(5,3;12,2)10-619,0 (6,1;20,0)3,3(3,3;6,7)0,14(0,0; 0,5)1,5(0,2; 1,7)Концентрация матриксных металлопротеиназ клеточного лизата, нг/млММР-3ММР-9Кон.конц-ия Ах,72 ч, n=996 ч, n=972 ч, n=1296 ч, n=12ММе (25;75)%Ме (25;75)%Ме (25;75)%Ме (25;75)%00,1 (0,1; 0,1)45,7(5,3; 54,8)0,5 (0,3; 1,2)0,9 (0,8; 1,1)10-443,0 (13,5;49,6)31,2 (25,3;35,5)0,4 (0,3; 0,9)1,36 (0,9; 1,9)10-524,6 (12,7;25,3)16,8 (14,8;16,9)0,9 (0,0; 0,9)0,1 (0,01;0,3)10-625,7 (18,2;31,2)14,1 (9,4;39,0)0,3 (0,1; 0,5)1,2 (0,8; 1,4)* статистически значимое увеличение концентрации ММР-3 при сравнении группыконтроля для 72 и 96 часов инкубации клеток р = 0,02 (Манн-Уитни тест);◊ статистически значимое увеличение концентрации ММР-9 при сравнении группыконтроля для 72 и 96 часов инкубации клеток р = 0,03 (Манн-Уитни тест);# статистически значимое увеличение концентрации ММР-3 при сравнении группыАх10-5М через 72 и 96 часов инкубации клеток р = 0,03 (Манн-Уитни тест).ВЛИЯНИЕ АЦЕТИЛХОЛИНА НА ЭКСПРЕССИЮ МОЛЕКУЛГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКАI И II КЛАССОВ И ФАЗЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛАМетодом проточной цитометрии было изучено влияние Ах на синтез поверхностных молекул комплексов гистосовместимости I и IIклассов.

Определили стандартные характеристики линии, не обработанной Ах (гистограмма-шаблон). Шаблон сравнивали с гистограмма11ми, полученными после обработки ОК. Анализ данных показал отсутствие статистически значимых различий между обработанными и необработанными Ах ОК.Влияние на клеточный цикл оценивали после обработки красителем, связывающимся с ДНК. Был создан шаблон-стандарт (представлен на рис.

5), с которым сравнивали экспериментальные образцы.Показано, что бóльшая часть ОК SW620 к 96-му часу переходит изпостсинтетической стадии клеточного цикла в пресинтетическую (G1),при этом процент клеток в стадии S (синтетическая стадия) заметно неизменяется. При внесении Ах к ОК (данные табл. 4) к 96-му часу происходили изменения соотношения количества ОК в фазе G1/G2, чтоуказывает на митогенное свойство Ах.Р и с . 5. Типичные настройки шаблона для определения фазклеточного цикла линии SW620 в начале экспериментаСлева показано распределение клеток популяции.