Автореферат (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo)

На правах рукописиСМИРНОВА АННА ВЯЧЕСЛАВНАПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕАЦЕТИЛХОЛИНА В ПРОЛИФЕРАЦИИОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ТОЛСТОЙ КИШКИIN VITRO И IN VIVO14.03.03. – Патологическая физиологияАвторефератдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукМ о с к в а 20171Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения города Москвы «Московский клинический научнопрактический центр Департамента здравоохранения города Москвы», Федеральном государственном автономном образовательном учреждениивысшего образования «Российский университет дружбы народов».Научный руководитель:Трубицына Ирина Евгеньевна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией доклинических исследований ГБУЗ МКНЦДЗМ.Официальные оппоненты:Тропская Наталия Сергеевна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной патологии Государственного бюджетного учреждения здравоохранениягорода Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им.

Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы»,Трофимов Владимир Александрович, доктор биологических наук, заведующий кафедрой генетики Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Национальный исследовательский Мордовский государственныйуниверситет им. Н.П. Огарева».Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имениК.И.

Скрябина».Защита диссертации состоится «21» июня 2017 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.06 при Российском университете дружбы народов по адресу: 1117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая,д. 8.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайтеФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (адрес: 117198,г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.

6; сайт: http://dissovet.rudn.ru).Автореферат разослан «_____»__________________2017 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.203.06,доктор биологических наук, доцент2М.М. АзоваОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. Рак толстой кишки (РТК) занимает первыеместа в структуре опухолевых заболеваний в экономически развитыхстранах [Давыдов М.И., 2011].

К факторам риска относят наследственную предрасположенность [Корчагина, 2009], возраст, хроническийстресс, длительное воспаление органов желудочно-кишечного тракта(ЖКТ) и нерациональное питание [Савицкий С.Э., 2009]. Особенностиразвития РТК не позволяют создать полноценную программу скриннига[Моисеенко В.М., Волков Н.П., 2014; Заридзе Д.Г., 2009] и/илиадекватную исследовательскую модель РТК [Corpet D.E, 2003].Биологически активные вещества нейроэндокринного происхождения, в том числе ацетилхолин (Ах), обладают способностью изменятьфизиологические процессы, происходящие в ЖКТ. Вопрос его влиянияна процесс воспаления достаточно изучен [Трубицына И.Е., 2004;Парфенов А.И., 2002; Трубицына И.Е., Винокурова Л.В., 2006;Коротько Г.Ф., 2009], однако остается много вопросов о его действии наначальный этап канцерогенеза при хроническом воспалении.

Слизистаяоболочка ЖКТ выполняет функции диффузной эндокринной железы.Она имеет как прямую, так и обратную связь с центральной нервной системой [Воробьев А.В., 2010]. Клетки этой системы – апудоциты – обеспечивают метаболизм биогенных аминов и ацетилхолина в частности.Благодаря Ах и его действию на эту систему происходит регуляция секреции пептидных гормонов, которые вовлечены в начальный этап ростаопухолевых клонов и способствуют их селекции [Blankenstein, 2005;Arias, et al., 2009].

В конце 90-х гг. ХХ века было показано одновременное нейрональное и ненейрональное влияние Ах: через систему рецепторов клеток слизистой оболочки кишки и через систему биологическиактивных веществ, выделяемых апудоцитами [Pelisser-Rota, et al., 2013].В 2000 гг. предположили, что Ах может продуцироваться и/или накапливаться опухолевыми клетками, стимулируя их рост в тканях [Delbro D.,2012; Novotny A., et al., 2011].

Установлено, что процессы нарушениягомеостаза Ах в тканях и опухолевый рост в слизистой оболочке толстойкишки (СОТК) связаны, а клетки многих клеточных линий экспрессируют рецепторы для Ах [Belo A., 2011; Pelisser-Rota, et al., 2011].Отсутствие полноценной экспериментальной модели, воспроизводящей опухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки улабораторных животных, является причиной активного исследованияисключительно генетических причин опухолей [Corpet D.E., 2003].Однако распространенность такого вида опухолей невелика, и,учитывая данный факт, требуется изучение спонтанного, а также3связанного с воспалением опухолевого роста. Таким образом,изучение роли Ах в процессах опухолевого роста как на изолированной системе (in vitro), так и в организме (in vivo) является актуальнымнаправлением для экспериментальной онкологии и патофизиологии.Разработанность темы.

Несмотря на активное изучение молекулярных механизмов возникновения опухолей, в том числе и РТК, остается неразработанной область нейро-иммуно-эндокринной регуляции.Вопрос о нейрональной регуляции опухолевого роста в кишечнике досих пор изучен недостаточно подробно, что объясняет актуальностьнастоящего исследования.Цели исследования. Установить возможные патофизиологическиемеханизмы влияния ацетилхолина на процесс пролиферации клетокэпителия слизистой оболочки толстой кишки in vivo и in vitro.Задачи исследования.1.

In vitro выявить влияние различных доз ацетилхолина на опухолевую клеточную линию SW620 (рак толстой кишки человека).2. Определить in vitro концентрации ацетилхолина, которые способствуют изменению количества митозов в популяции опухолевыхклеток.3. Выявить in vitro влияние ацетилхолина на уровень экспрессииповерхностных молекул главного комплекса гистосовместимости I и IIклассов.4. Создать экспериментальные модели для изучения начальныхэтапов роста опухоли толстой кишки у крыс.5. Определить изменение концентрации ацетилхолина в слизистойоболочке толстой кишки в динамике заживления язвенного дефекта.6. Определить влияние ацетилхолина на изменение концентрацииэпидермального фактора роста, матриксных металлопротеиназ 3 и 9типов в экстрактах слизистой оболочки толстой кишки у крыс.Научная новизна. Впервые для исследования патофизиологического значения ацетилхолина в разных модельных системах применили метод параллельного изучения факторов межклеточного взаимодействия: эпидермального фактора роста и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов.

Впервые разработана модель опухолевого роста втолстой кишке у крыс путем индукции воспаления в сочетании с введением 1,2-азоксиметана. Определены факторы, влияющие на ростполипов толстой кишки у крыс с разным способом индукции первичной трансформации. Впервые параллельно in vitro и in vivo определеновлияние ацетилхолина на концентрацию матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов и эпидермального фактора роста.4Теоретическая и практическая значимость работы. Показанатесная взаимосвязь между процессом пролиферации клеток толстойкишки крыс как в нормальной ткани, так и на фоне воспалительногопроцесса. Концентрация ацетилхолина в образцах тканей может бытьиспользована в качестве маркера фазы воспаления слизистой оболочкитолстой кишки.

Разработанные модели могут быть использованы вэкспериментальной патофизиологии.Методология и методы исследования. Методы поиска, анализа иобобщения литературных данных; методы моделирования и ветеринарной работы: наблюдение, оперативное вмешательство и послеоперационный уход; методы работы с клетками эукариот; биохимическиеметоды исследования: титрование по Хестрину в модификации Трубицыной И.Е.; методы работы на проточном цитометре: реакция прямойиммунофлюоресценции, работа с витальными красителями для работыс клетками; методы аналитической химии: приготовление растворов,измерение оптической плотности растворов, измерение рН среды; методы математической обработки полученных экспериментальных данных: анализ данных на распределение, проведение исследования внутри экспериментального массива, сравнение между сериями экспериментальных данных.Внедрение результатов.

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского института РУДН.Основные положения, выносимые на защиту.1. Ацетилхолин оказывает влияние на опухолевые клетки SW620 invitro. В зависимости от дозы он может как стимулировать рост клеток,так и вызывать их гибель.2. Ацетилхолин in vitro в низких концентрациях (от 10-4М и ниже)способен влиять на синтез интрацеллюлярных молекул эпидермального фактора роста и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов.3.

In vivo концентрация Ах в первые трое суток от начала воспаления определяет нормальную пролиферативную активность клеток взоне альтерации.4. Разработанные экспериментальные модели позволяют изучатьначальные этапы роста опухоли толстой кишки у крыс.5. Изменение концентрации Ах в ранний послеоперационный период является маркером воспалительного процесса.Степень достоверности полученных данных. Клетки линииSW620 были использованы согласно договору о безвозмездном научномсотрудничестве между ЦНИИГ и Федеральным государственным бюджетным учреждением «Российский онкологический научный центр им.5Н.Н. Блохина» Минздрава России. Для работы на клеточной культуреиспользовали стандартную производственную питательную среду икондиционирующие добавки, телячью эмбриональную сыворотку, сертифицированную для работы с культурами клеток (все производстваПанЭко, РФ).