Автореферат (Изучение активности пептидгидролаз в злокачественных новообразованиях человека), страница 2

Изучение активностиферментов было проведено у 160 человек в возрасте от 35 до 70 лет. Новообразованияклассифицировали в соответствии с клиническими признаками и результатамигистологического анализа. Были сформированы следующие группы образцов:1) ткани кишечника без патологических изменений (n=11);2) ткани желудка без патологических изменений (n=11);3) ткани молочной железы без патологических изменений (n=11);4) ткани почек без патологических изменений (n=11);5) ткани печени без патологических изменений (n=11);6) ткани легких без патологических изменений (n=11);7) полипы толстой кишки (n=12);8) полипы желудка (n=11);9) фиброкистозная мастопатия молочной железы (n=12);10) аденомы почек (n=12);11) фиброма печени (n=11);12) фиброма легких (n=11);13) аденокарцинома толстой кишки (n=14);14) аденокарцинома желудка (n=11);15) протоковая карцинома молочной железы (n=15);16) почечноклеточный рак почек (n=11);17) аденокарцинома печени (n=13);18) аденокарцинома легких (n=11).Пробы замораживали и хранили при - 40° С для последующего анализа.Для определения активности нелизосомальных пептидгидролаз навески тканигомогенизировали в 50 мМ натрий ацетатном буфере, содержащем 50 мМ NaCl, рН 5,6, всоотношении 1 : 50 (вес : объем), для определения активности кислых протеаз и катепсинаD – в 100 мМ натрий ацетатном буфере, рН 4,0.Активность карбоксипептидазы Е определяли флуориметрически (λex=360 нм иλem=530 нм) по гидролизу субстрата дансил-фен-ала-арг при рН 5,6, в качестве ингибитораиспользовалиГЭМЯК(Fricker,1982).АктивностьФМСФ-ингибируемойкарбоксипептидазы определяли флуориметрически (λex=360 нм и λem=530 нм)(Генгин, 2002) по гидролизу дансил-фен-лей-арг при рН 5,6, в качестве ингибитораиспользовали ФМСФ.

Активность пептидил-дипептидазы А определяли фотометрическипо отщеплению Gly-Arg от карбоксибензоил-Gly-Gly-Arg при рН 8,2, с использованиемкаптоприла в качестве ингибитора (Hurst, 1981). Активность лейциламинопептидазыопределяли флуориметрически (λex=420 нм и λem=530 нм) по гидролизу лей-β-7нафтиламина при рН 7,4, в качестве ингибитора использовали пуромицин. Активностькислых протеаз и катепсина D определяли фотометрически по расщеплению бычьегогемоглобина при рН 4,0, в качестве ингибитора катепсина D использовали пепстатин А.Концентрацию белка в гомогенатах определяли по Лоури (Lowry, 1951).Активность ферментов определяли как разницу прироста флуоресценции илиоптических единиц в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали внмоль продукта (по соответствующей калибровочной зависимости), образовавшегося за 1мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.Проверкапринадлежностираспределенияпризнаковкнормальномураспределению производилась по критерию хи-квадрат.

Достоверность отличий междусредними величинами определяли с использованием t-критерия Стьюдента идисперсионного анализа (Лакин, 1990).РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕВ результате проведенной работы установлено, что активность всех исследованныхферментов в доброкачественных новообразованиях анализируемых тканей была выше посравнению с нормальными тканями (рис.

1 - 6). При этом для всех ферментов отмечаетсяутрата тканеспецифического паттерна активности, свойственного здоровым тканям. Повидимому, повышение активности всех пептидгидролаз – ферментов процессинга,модификации и деградации регуляторных белков и пептидов до одного уровня характернодля всех тканей с измененным типом роста и характеризующихся повышенным уровнемобмена пептидных молекул.Следует отметить, что в нашей работе впервые описано тканевое распределениеактивности ФМСФ-КП. Установлено, что активность данного фермента во всех тканях в2-3 раза выше активности КПЕ, которая присутствует в соматических тканях в следовыхколичествах.

Подобное распределение сходно с таковым у других млекопитающих(Генгин М.Т. Вернигора А.Н 1996, Вернигора А.Н. 2003), что подтверждаетпредположение о более широких функциях ФМСФ-КП, принимающей участие, в отличиеот КПЕ, не только в процессинге регуляторных пептидов и белков, но и в обмене идеградации других белковых молекул.Результаты исследования показали увеличение активности кислых протеаз взлокачественных новообразованиях молочной железы (инвазивная протоковая карцинома)на 35 %, желудка (аденокарцинома) на 115 %, почек (почечноклеточный рак) на 140 %,печени (аденокарцинома) и легких (аденокарцинома) на 30 % по сравнению сдоброкачественными новообразованиями в этих же органах (рис. 1).Так, значение активности кислых протеаз в злокачественных новообразованияхжелудка и почек превышала активность кислых протеаз в доброкачественныхновообразованиях в 3 раза, тогда как в злокачественных новообразованиях молочнойжелезы, легких и печени - в 1,5 раза.80,80,60,40,201,52*+0,5012+*10,50121,5*10,50132Почки2,53+21,5*10,5013Легкие1,5+23Молочная железа1Желудок2,53нмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка*11нмоль/мин на мг белка3Кишечникнмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка1,223Печень1,5+*10,50123Рисунок 1.

Активность кислых протеаз в здоровых тканях (n = 11),доброкачественных и злокачественных новообразованиях кишечника (n = 12 и 14соответственно), желудка (n = 16 и 16 соответственно), молочной железы (n = 12 и 15соответственно), почек (n = 12 и 11 соответственно), легких (n = 11 и 11соответственно) и печени (n = 11 и 13 соответственно) человека.1 – здоровые ткани, 2 – доброкачественные новообразования, 3 – злокачественныеновообразования, M ± m; * – р < 0,001 по сравнению со здоровыми тканями, + – р <0,001 по сравнению с доброкачественными опухолями.Установлен рост активности катепсина D в злокачественных новообразованиях всехисследованных органов по сравнению с доброкачественными опухолями (рис.

2). При этомзначение активности катепсина D в злокачественных новообразованиях желудка и почек посравнению с активностью катепсина D в доброкачественных новообразованиях была выше в 6раз, в злокачественных новообразованиях кишечника – в 2 раза, а в злокачественныхновообразованиях легких, печени и молочной железы – в 3 раза. Активность катепсина D также9была значительно выше во всех исследуемых злокачественных новообразованиях посравнению с контрольной группой здоровых тканей.0,6*0,40,20нмоль/мин на мг белка11,52Молочная железа+02+1*0,501221*0,50132Почки2,53+21,51*0,503Легкие1,5+1,53*0,5Желудок2,5311нмоль/мин на мг белка+нмоль/мин на мг белка0,83нмоль/мин на мг белкаКишечник1нмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка12Печень1,53+1*0,50123Рисунок 2. Активность катепсина D в здоровых тканях (n = 11), доброкачественныхи злокачественных новообразованиях кишечника (n = 12 и 14 соответственно),желудка (n = 16 и 16 соответственно), молочной железы (n = 12 и 15 соответственно),почек (n = 12 и 11 соответственно), легких (n = 11 и 11 соответственно) и печени (n =11 и 13 соответственно) человека.1 – здоровые ткани, 2 – доброкачественные новообразования, 3 – злокачественныеновообразования, M ± m; * – р < 0,001 по сравнению со здоровыми тканями, + – р <0,001 по сравнению с доброкачественными опухолями.Во всех доброкачественных опухолях активность катепсина D составляла не более50% от активности кислых протеаз, тогда как в раковых опухолях всех исследованныхтканей активность катепсина D составляла от 82 до 100 % от общей активности кислых10протеаз, что указывает на преобладающую роль данного фермента среди ферментов сосходнымифизико-химическимисвойствамивпроцессахзлокачественногоновообразования (таблица 1 - 3).Таблица 1.

Соотношение активности катепсина D и общей активности кислыхпротеаз в здоровых тканях.Здоровые тканиАктивностькислыхпротеазАктивностькатепсина DАк-ть катепсина D /общ.акт-тькислых протеаз, %Кишечник0,500,2346Желудок0,530,21390,650,1929Почки0,340,1029Легкие0,440,1534Печень0,550,2545Молочная железаТаблица 2. Соотношение активности катепсина D и общей активности кислых протеаз вдоброкачественных новообразованиях.ДоброкачественныеАктивностьАктивностьАк-ть катепсина D /общ.актновообразованиякислыхкатепсина Dть кислых протеаз, %протеазКишечник0,850,3541Желудок0,830,35420,880,3539Почки0,850,3541Легкие0,810,3543Печень0,820,3542Молочная железаТаблица 3.

Соотношение активности катепсина D и общей активности кислых протеаз взлокачественных новообразованиях.ЗлокачественныеАктивностьАктивностьАк-ть катепсина D /общ.актновообразованиякислыхкатепсина Dть кислых протеаз, %протеазКишечник0,910,7582Желудок2,302,30100100Молочная железа1,101,10Почки2,402,3597Легкие1,201,20100Печень1,201,20100Результаты исследования (рис. 3) показали значительное увеличение активностиКПЕ в злокачественных новообразованиях молочной железы, кишечника, желудка ипочек по сравнению с доброкачественными новообразованиями в этих же органах.11*0,10,050нмоль/мин на мг белка10,22*0,10,0502*0,101*Почки3+0,30,2*0,10123Печень0,1*0,080,0620,43Легкие0,080,2нмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка10,30,5++0,43Молочная железа0,15нмоль/мин на мг белка+0,15Желудок0,5нмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белкаКишечник0,060,040,040,020,0201230123Рисунок 3.

Активность КПЕ в здоровых тканях (n = 11), доброкачественных излокачественных новообразованиях кишечника (n = 12 и 14 соответственно),желудка (n = 16 и 16 соответственно), молочной железы (n = 12 и 15 соответственно),почек (n = 12 и 11 соответственно), легких (n = 11 и 11 соответственно) и печени (n =11 и 13 соответственно) человека.1 – здоровые ткани, 2 – доброкачественные новообразования, 3 – злокачественныеновообразования, M ± m; * – р < 0,001 по сравнению со здоровыми тканями, + – р <0,001 по сравнению с доброкачественными опухолями.Значение активности КПЕ в клетках низкодифференцированной аденокарциномыжелудка более чем в 50 раз превышало активность КПЕ в доброкачественныхновообразованиях желудка, почек – в 40 раз, желудка и кишечника – более чем в 10 раз. Взлокачественных новообразованиях печени и легких активность КПЕ не отличалась отзначений, наблюдаемых в доброкачественных новообразованиях.ФМСФ-КП в опухолевой ткани человека показывает схожее с КПЕ распределениеактивности (рис.

4).Кишечник ++1,51*0нмоль/мин на мг белка11,5++*02*0,40,30,20,101242*0132Почки0,63++*0,40,203Легкие0,5++60,810,5Желудок83Молочная железа1нмоль/мин на мг белка2нмоль/мин на мг белка0,51нмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка2нмоль/мин на мг белка1223Печень0,8+0,6*0,40,20123.Рисунок 4. Активность ФМСФ-КП в здоровых тканях (n = 11), доброкачественных излокачественных новообразованиях кишечника (n = 12 и 14 соответственно),желудка (n = 16 и 16 соответственно), молочной железы (n = 12 и 15 соответственно),почек (n = 12 и 11 соответственно), легких (n = 11 и 11 соответственно) и печени (n =11 и 13 соответственно) человека.1 – здоровые ткани, 2 – доброкачественные новообразования, 3 – злокачественныеновообразования, M ± m; * – р < 0,001 по сравнению со здоровыми тканями, + – р <0,01, ++ – р < 0,001 по сравнению с доброкачественными опухолями.По результатам эксперимента показано, что активность ФМСФ-КП достоверновыше в злокачественных новообразованиях молочных желез, желудка, кишечника, почеки печени, чем в доброкачественных новообразованиях в этих же органах.130,8*0,60,40,200,820,40,202*0,60,40,20120,40,20132Почки0,83++*0,60,40,2013Легкие0,8++*0,61*1Желудок0,83Молочная железа0,61нмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка1нмоль/мин на мг белка+нмоль/мин на мг белкаКишечникнмоль/мин на мг белканмоль/мин на мг белка123Печень0,8*0,60,40,20123Рисунок 5.