Автореферат (Эндофитные сообщества сфагновых мхов как источник бактерий - эффективных ассоциантов сельскохозяйственных культур), страница 2

Впервые в мире, созданы эффективные лабораторные образцы микробиологических препаратов на основе эндофитныхбактерий, выделенных из сфагновых мхов.Практическая значимость работы. Создана коллекция штаммов эндофитныхмикроорганизмов,характеризующихся наличием важных, хозяйственно-ценныхсвойств, таких как антагонизм по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям,ростстимуляция, способность к мобилизации малодоступных для растения соединенийфосфора, ферментативная активность и др. Наиболее перспективные штаммы депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов сельскохозяйственного назначения.

Апробирована технология получения и применения лабораторных образцов микробных препаратов на основе эндофитных бактерий сфагновых мхов.Основные положения, выносимые на защиту:1. Внутри тканей сфагновых мхов локализуются эндофитные бактериальные сообщества.2. В компонентном составе гетеротрофных бактериальных сообществ сфагновыхмхов различного географического происхождения преобладают представителиродов Pseudomonas, Serratia, Burkholderia, Flavobacterium, Collimonas,Stenotrophomonas.3.

Культивируемые гетеротрофные бактерии сфагновых мхов обладают комплексом свойств, которые играют важную роль не только в жизни растенияхозяина, но и могут быть использованы в практических целях.4. Штаммы бактерий, выделенные из тканей сфагновых мхов, способны активновзаимодействовать с высшими растениями сельскохозяйственного значения иоказывать положительное влияние на их рост и развитие.4Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы и результаты исследований докладывались на: Всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России» (14-15 апреля 2010 г., г. Москва, Россия); 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (19-23 апреля 2010 года, г. Пущино, Россия); международной конференции «Biological control of fungal and bacterial plant pathogens» (7-10 июня 2010, г. Грац, Австрия); международной научно-практической школемолодых ученых и минисимпозиуме «Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology» (12-17 июля 2010, г. Миккели,Финляндия); международной бриологической конференции, посвященной 110-летию содня рождения З.Н.

Смирновой и К.И. Ладыженской «Бриология: традиции и современность» (2010, г. С.Петербург, Россия); 4-ой международной конференции«Environmental, Industrial and Applied Microbiology» (14-16 сентября 2011, г. Торремолинос, Испания); международной конференции «Current aspects of european endophyte research» (28-30 марта 2012, г. Реймс, Франция); 16-ой Пущинской международной школеконференции молодых ученых, (16-21 апреля 2012, г. Пущино, Россия); 7-ой конференции «Перспективы использования новых форм удобрений, средств защиты и регуляторов роста растений в агротехнологиях сельскохозяйственных культур» (2012, г. Анапа,Россия); международной бриологической конференции, посвященной 100-летию со днярождения Р.Н.

Шилякова (24-26 июня 2012 г., г. Апатиты, Россия); международнойконференции «Endophytes: from discovery to application» (14-16 ноября 2012 г, г. СанМишель, Италия).Работа выполнена в рамках Российско-Австрийского проекта при финансовойподдержке гранта РФФИ № 09-04-91007_АНФЛичный вклад соискателя. Представленные экспериментальные и теоретические результаты получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспедиций и экспериментов, вегетационных опытов и полевых исследований, обработке и обсужденииполученных результатов, подготовке публикаций. Идентификация образцов сфагновыхмхов выполнялась совместно со специалистами в области ботаники Бергом К.

(Ботанический институт, Карл-Франсес университет, Грац, Австрия), Кузьминой Е.Ю. (Ботанический институт им. Комарова РАН, С.Петербург, Россия), Лапшиной Е.Д. (Югорскийгосударственный университет, Ханты-Мансийск, Россия). Методики FISH и CSLM были освоены под руководством и при непосредственном участии Брагиной А.В. и Кардинале М. (Институт природоведческой биотехнологии, Технологический университет,Грац, Австрия), а также сотрудников лаборатории молекулярной и клеточной биологииГНУ ВНИИСХМ.

Определение концентрации ауксинов в культуральной жидкости выполнено при участии к.б.н. Шапошникова А.Н. (ГНУ ВНИИСХМ). Часть работ выполнена с использованием оборудования ЦКП "Геномные технологии и клеточная биология" ГНУ ВНИИСХМ.Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 30 работ, в том числе: 9 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, из них 3 статьи в ведущих иностранных журналах, 1 глава вкниге, получен 1 патент.Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатовисследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, состоящего5из 400 источников (из них – 376 иностранных) и приложений. Материалы диссертацииизложены на 179 страницах машинописного текста, иллюстрированы 44 таблицами и31 рисунком.Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫПредставлены сведения об экологической роли, распространѐнности, видовомсоставе микроорганизмов болотных экосистем. Обобщены результаты исследованиймикроорганизмов, ассоциированных с растениями рода Sphagnum.Рассмотрены материалы о полезных растительно-микробных системах в сельскохозяйственной биотехнологии.Изложены результаты и перспективы практического использования эндофитных бактерий.Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ2.1. Сбор образцов сфагновых мхов. В представленной диссертационной работе эндофитные бактерии выделяли из гаметофитов сфагновых мхов двух видов:Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H.

Klinggr. и S. magellanicum Brid. Образцы сфагновыхмхов отбирали в ходе экспедиций на территории трех географически удаленных регионов (табл.1): Австрийских Альп, Ленинградской области, Западной Сибири (ХантыМансийский автономный округ).Таблица 1. География отбора образцов сфагновых мхов в 2009-2012 гг.РегионотбораАвстрийскиеАльпыЛенинградская областьЗападнаяСибирьТочка отбораГеографическиекоординатыN 47°41′ E 15°09′Дата отбора02.09.2009N 47°18′ E 12°24′03.09.2009N 47°34′ E 14°20′04.09.2009Урочище «Полесье»(Россия, Ленинградская область, Выборгский р-н)Озеро Волоярви (Россия, Ленинградская область,Всеволожский р-н)Урочище «Кордон Кирпичный» (Россия, Ленинградская область, Гатчинский р-н)N 60°44′ E 29°04′19.07.2010N 60°18′ E 30°48′03.10.2009N 59°16′ Е 29°54′06.10.2011Болото «Чистое» у п. Шапша (Россия, ХантыМансийский АО)Болото «Мухрино» (Россия, Ханты-МансийскийАО)Болото «Кукушкино» у 45 км трассы ХантыМансийск – Нефтеюганск (Россия, ХантыМансийский АО)N 61°03′ Е 69°27′30.08.2012N 60°53′ Е 68°41′31.08.2012N 60°57′ Е 69°41′01.09.2012“Rootmoos” (Австрия, федеративная земля Штирия)“Waasenmoos” (Австрия, федеративная земляЗальцбург)“Pürgschachen” Moor (Австрия, федеративнаяземля Штирия)Идентификация видов сфагновых мхов проводилась в полевых условиях поанатомо-морфологическим признакам в соответствии с определителем сфагновыхмхов (Ignatov et al., 2006).

В указанных болотных экосистемах образцы мха каждого6вида отбирали в четырех точках, удаленных друг от друга на расстоянии 50-100 м.При отборе пучок из 50-100 растений извлекали вручную с помощью стерильных перчаток из растительного массива, помещали в стерильный пластиковый пакет, которыйв тот же день в охлажденном виде доставляли в лабораторию для дальнейших исследований.

Для каждой точки отмечали географические координаты, описывали характер окружающей растительности, температуру и pH воды.2.2. Пространственная локализация бактерий, ассоциированных со сфагновымимхами, при помощи флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (CSLM). Растительный материал (гаметофиты растений) отмывали от частиц посторонних включений и растительных остатков стерильным буфером PBS, разрезали в асептических условиях на секции размером 1,5-2,0см и фиксировали в течение 18 ч при температуре +4°С. Флуоресцентную in situ гибридизацию проводили по описанной ранее методике (Cardinale et al., 2011; Щербаковс соавт., 2013) с использованием следующих универсальных и групп-специфичныхолигонуклеотидных проб: эквимолярную смесь олигонуклеотидных проб EUB338,EUBII338, EUBIII338 (Amann et.

al., 1990; Daims et al., 1999) - универсальную пробудля всех эубактерий, маркированную флуорохромом Cy3; BET42a и GAM42a – специфичныепробыдляпредставителейклассовBetaproteobacteriaиGammaproteobacteria (Manz et al., 1992), маркированные флуорохромами Cy-5 и6FAM, соответственно. Конфокальную сканирующую лазерную микроскопию выполняли с использованием микроскопа Leica TCS SPE (Leica Mycrosystems, Германия). Для детекции олигонуклеотидных проб, меченных флyорохромами 6FAM, Cy3 иCy5, использовали лазеры с длиной волны 488, 532 и 635 нм. Флyоресценцию регистрировали в диапазоне 508-566 нм, 665-607 нм и 657-709 нм соответственно. Трехмерную реконструкцию изображений выполняли с использованием программы Imaris7.0 (Bitplane, Швейцария).2.3. Выделение эндофитных бактерий и создание коллекции штаммов с хозяйственно-ценными свойствами.