Автореферат (Нивелирование влияния биологической матрицы при определении лекарственных препаратов в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии)

Санкт-Петербургский государственный университетНа правах рукописиЯРОШЕНКО ДМИТРИЙ ВАДИМОВИЧНИВЕЛИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МАТРИЦЫ ПРИОПРЕДЕЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИМЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИСпециальность 02.00.02 – АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯАвторефератдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукСанкт-Петербург2014Работа выполнена в ФГБОУ ВПО "Санкт-Петербургский государственный университет"Научный руководитель:Карцова Людмила АлексеевнаДоктор химических наук, профессорОфициальные оппоненты:Эпштейн Наталья Борисовнадоктор фармацевтических наук, доцент.Обнинский институт атомной энергетикиНационального исследовательского ядерногоуниверситета МИФИ, кафедрафармацевтической и радиофармацевтическойхимии, заведующая кафедрой.Стрельникова Елена Геннадьевнакандидат химических наук.Северо-Западный государственный медицинскийуниверситет им.

И.И. Мечникова, НИЛхроматографии НИИ эндокринологии,старший научный сотрудник.Ведущая организация:ФГБВОУ ВПО "Военно-медицинская академияим. С.М. Кирова" МО РФЗащита состоится 16 октября 2014 г., в 15:00 ч.На заседании диссертационного совета Д 212.232.37 по защите докторских и кандидатскихдиссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034,Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43.Большая химическая аудитория.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургскогогосударственного университета. Диссертация и автореферат размещены на сайтеwww.spbu.ru.Автореферат разослан __________________ 2014 г.Ученый секретарьДиссертационного совета/ В.В.Панчук /Актуальность:При разработке методик определения лекарственных препаратов в плазме кровичасто возникают проблемы, связанные с мешающим воздействием биологической матрицына масс-спектрометрическое определение аналитов.

Выявление подобных проблем и поискпутей их устранения весьма актуальны. Это связано, в первую очередь, с бурным развитиемфармацевтической промышленности и, соответственно, возросшим интересом научногосообщества к изучению лекарственных веществ в биологических жидкостях.Измерение концентрации лекарственных препаратов в биологических матрицахявляется важным аспектом получения фармацевтических данных. Они необходимы длярегистрации в государственном реестре новых активных субстанций и дженериков.Результатыдоклиническихиклиническихиспытаний,включаяисследованиябиоэквивалентности, используются для принятия важных решений, подтверждающихбезопасность и эффективность лекарственного вещества.Стремительное развитие фармацевтической отрасли требует разработки комплексасовременных высокочувствительных валидированных методик определения как новыхлекарственных препаратов, так и дженериков.

Высокий уровень требований к подобнымметодикам строго регламентирован на международном уровне 1. Однако наличие дажесамой современной аналитической аппаратуры не гарантирует успеха без грамотноговыбора процедуры пробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологическихматриц.В современной практике определения лекарственных препаратов в биологическихобъектах наиболее предпочтительно использование методов ВЭЖХ и хромато-массспектрометрии.

При этом компоненты биологической матрицы могут коэлюироваться саналитами и обнаруживаться в виде различных мешающих эффектов: подавлениеионизации, усиление аналитического сигнала, плохая сходимость для биообразцовразличных доноров и др.Большинство лекарственных веществ имеет высокую степень связывания с белкамикрови. Поэтому при изучении фармакокинетики определение лекарств рекомендуетсяпроводить именно в плазме крови, которая имеет сложную матрицу, существенноотличающуюся по составу для разных доноров. Согласно международным рекомендациямЕвропейского Медицинского Агентства (EMA – European Medicines Agency) при1European Medicines Agency - Committee for Medicinal Products for Human Use.

2011.3использовании масс-спектрометрического детектирования матричный эффект должен бытьоценен на образцах биологической матрицы не менее шести различных доноров.В большинстве публикаций, посвященных определению лекарственных веществ вплазме крови, проблема влияния матрицы не нашла должного освещения.Цель работы: Установление влияния матричных эффектов на результаты хроматомасс-спектрометрическогоопределениялекарственныхпрепаратов(цисплатина,силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила) в плазме крови ипоиск путей его устранения.В данной работе в качестве аналитов представлены следующие фармацевтическиесредства: цисплатин и капецитабин – противоопухолевые препараты; силденафил –применяется при лечении эректильной дисфункции; циклосерин – антибиотик, включаемыйв лекарственную терапию при лечении туберкулеза, ропинирол – средство против болезниПаркинсона.

Их выбор обусловлен высокой терапевтической важностью и недостаточнойизученностью.Для реализации цели необходимо было:1. Провести градацию матричных эффектов при хромато-масс-спектрометрическомопределении лекарственных веществ в плазме крови.2. Выявить характер матричного влияния при ВЭЖХ-МС определении цисплатина,силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови.3.Нивелироватьматричныеэффектыприопределениивсехупомянутыхлекарственных веществ.Научная новизна:Предложенвариантустраненияматричногоэффекта,выражающегосявнеудовлетворительной сходимости результатов для образцов плазмы крови различныхдоноров, при определении цисплатина в форме трехлигандного комплекса платины идиэтилдитиокарбамата(DDTC)–Pt(DDTC)3+;дляобнаруженияцисплатинавбиологических жидкостях указанная аналитическая форма применена впервые.Предложен способ устранения эффекта усиления аналитического сигнала притандемном хромато-масс-спектрометрическом определении силденафила, основанный навыборе приемлемого осколочного иона (MRM-переход 475→58).Выявлена проблема нарушения линейности градуировочной зависимости, связаннаяс влиянием компонентов биологической матрицы на ионизацию в масс-спектрометрии, ипредложены способы устранения указанного эффекта за счет снижения объема вводимойпробы при определения циклосерина и выбора сорбционного концентрирования на4катионообменном сорбенте Waters Oasis MCX для пробоподготовки плазмы крови приопределении ропинирола.Применен прием перевода сорбента в аммонийную форму при сорбционномконцентрировании циклосерина и ропинирола из плазмы крови на катионообменномсорбенте Waters Oasis MCX.

В предложенном приеме ионы аммония используются вкачестве конкурирующего агента, который снижает потенциальную возможностьвзаимодействия молекул аналита с сорбентом, что облегчает элюирование и позволяетувеличить степень извлечения аналитов.Установлено, что использование сверхсшитого полистирола PuroSep 200 присорбционном концентрировании позволяет устранить матричный эффект подавленияионизации при одновременном определении капецитабина и 5-фторурацила в плазмекрови, а также обеспечить высокие степени извлечения аналитов (98±2% – длякапецитабина и 84±1% – для 5-фторурацила).Практическая значимость работы:Разработана и валидирована в соответствии с международными требованиямиметодика количественного хромато-масс-спектрометрического определения цисплатина вплазме крови. Предложенная методика апробирована при изучении общей токсичности припроведении изолированной перфузии легкого цисплатином (совместно с НИИ Онкологииим.

Петрова).Разработаны и валидированы в соответствии с международными критериямиметодикиопределениясилденафила,циклосерина,ропинирола,капецитабинаи5-фторурацила в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии. С применениемразработанных методик проведены клинические исследования биоэквивалентности вбиоаналитическом центре «ЦКП «Аналитическая Спектрометрия».Положения, выносимые на защиту:1. Способы устранения матричных влияний при хромато-масс-спектрометрическомопределении цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина,5-фторурацила в плазме крови;2.

Перевод сорбента Waters Oasis MCX в аммонийную форму при сорбционномконцентрировании как способ решения проблемы сильного связывания аналита ссорбентом при определении циклосерина и ропинирола.3. Реализациянайденныхметодическихисследованиях лекарственных средств.5решенийвфармакокинетическихПубликации и апробация работы:Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 8 тезисах. Результатыисследований докладывались на V Всероссийской конференции студентов и аспирантов смеждународным участием «Химия в современном мире» (2011, СПб); XIX Менделеевскомсъезде по общей и прикладной химии (2011, Волгоград); VI Всероссийской конференциимолодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012»(2012, СПб); Всероссийском симпозиуме «Кинетика и динамика обменных процессов»(2012, Краснодарский край); XVII Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых испециалистов (2012, СПб); VII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантови студентов с международным участием «Менделеев-2013» (2013, СПб); Всероссийскойконференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2013,Краснодар); VIII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов смеждународным участием «Менделеев-2014» (2014, СПб).Структура и объём работыДиссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальнойчасти, 3 глав с обсуждением полученных результатов, списка принятых сокращений ииспользуемых биомедицинских терминов, заключения и списка цитируемой литературы(135 наименований).

Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит21 таблицу и 62 рисунка.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы целиисследования. Отмечена необходимость изучения матричных эффектов, возникающих приопределении лекарственных препаратов в биологических жидкостях (плазма крови)методом хромато-масс-спектрометрии и обоснована важность поиска путей устранениямешающего влияния компонентов биологической матрицы при разработке методик дляпроведения клинических испытаний.1-ая глава (Обзор литературных данных) включает разделы, содержащие общиетребования к физико-химическим методам, применяемым при проведении клиническихисследованийпреимущества(иммунологических,ВЭЖХ-МС/МСхроматографических,передостальнымимасс-спектрометрических);методамиприполучениифармакокинетических данных и проблемы количественного определения лекарственныхсредств, вызванные мешающим влиянием компонентов биологической матрицы.6Во 2-ой главе описываются экспериментальные характеристики и процедурыразработанных и валидированных методик анализа плазмы крови для определениялекарственныхпрепаратовцисплатина,силденафила,циклосерина,ропинирола,капецитабина и 5-фторурацила.В 3-ей главе предметом обсуждения является выявление и устранение матричныхэффектов, приводящих к неудовлетворительной сходимости результатов анализа прихромато-масс-спектрометрическомопределениицисплатина,силденафила,капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови различных доноров.Приразработкеметодикихромато-масс-спектрометрическогоопределенияпротивоопухолевого препарата цисплатина для его идентификации в плазме крови наосновании литературных [1]2 рекомендаций получен двухлигандный комплекс платины идиэтилдитиокарбамата (DDTC) по реакции:NH3ClPt+ 2NH3ClSSC-SNN-2NH3-2ClSPtCSCNSВ ходе предварительных экспериментов для извлечения комплекса Pt(DDTC)2 изплазмы крови разработана процедура сорбционного концентрирования комплекса нагидрофильно-липофильном сорбенте Oasis HLB, включающая стадии промывки сорбента50%-ым раствором метанола после загрузки образца для удаления компонентовбиологической матрицы и элюирования комплекса платины ацетонитрилом.При этом возникла проблема, связанная с проявлением матричного эффекта:наблюдалась плохая сходимость значений матричного фактора MF для комплексаPt(DDTC)2 при его определении в плазме крови различных доноров (табл.1).