Отзыв официального оппонента (Белки плотных контактов секреторного эпителия молочной железы мыши)

Отзыв официального оппонента на диссертацию Кругловой Натальи Михайловны на тему «Белки плотных контактов секреторного эпителия молочной железы мыши», представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.03.01 — «физиология» Диссертационная работа Кругловой Натальи Михайловны посвящена одной из актуальных проблем в области физиологии — роли различных белков одного семейства в осуществлении и повышения эффективности функций клеток.

В данной работе внимание сконцентрировано на изучении молекулярного многообразия белков плотных контактов — клаудинов, в механизмах межклеточного взаимодействия и парацеллюлярного транспорта в эпителии молочной железы мыши. Задуманное исследование в значительной степени базировалось на достижениях отечественной школы физиологии лактации. созданной профессором И.И.

Грачевым. Эта школа, зародившаяся в стенах СПбГУ (тогда — ЛГУ), в 60-е-80-е годы прошлого столетия объединяла физиологов, работавших в разных городах России и союзных республик. Приятно сознавать, что некоторые ученики и последователи этой школы работают здесь и сейчас, на кафедре общей физиологии. Что касается представляемой диссертационной работы, можно только приветствовать обращение к молочной железе как физиологической модели с новых позиций, используя современные методы исследований и молекулярно-биологические подходы.

Сочетание в работе данных об особенностях межклеточных контактов между эпителиальными клетками альвеол молочной железы с разработкой физиологической модели механического растяжения альвеол позволило подойти к решению актуальной проблемы физиологии лактации — изучению сохранения целостности структуры альвеолы в условиях механических воздействий и формированию секрета в полости альвеол. Благодаря тщательному анализу литературных источников„разработке перспективной физиологической модели исследования автор четко сформулировал цели и задачи своей работы. Применение различных молекулярно-биологических методов, электронной микроскопии позволило получить объективные экспериментальные данные, направленные на изучение роли клаудинов, входящих в структуру плотных контактов секреторного эпителия альвеол, в осуществлении функций молочной железы мыши в период лактации.

Новизна представленной работы Впервые изучена мозаика клаудинов в плотных контактах эпителия молочной железы мыши, впервые установлено наличие в эпителни альвеол молочной железы клаудина-2, -5, -8, -12, -15 и -17. Получены новые данные„ свидетельствующие о том. что в эпителии молочной железы имеются клаудины, образующие парацеллюлярные поры для диффузии ионов н воды, а также клау дины, ограничивающие проницаемость эпителия. Разработана физиологическая модель растяжения альвеол молочной железы, позволяющая оценить вклад клаудинов в сохранение структуры альвеол.

Впервые показано, что накопление секрета в полости альвеол молочной железы влияет на уровень клаудинов, изменяющих межклеточную проницаемость эпителия. К приоритетным положениям диссертации можно отнести вывод о том, что белки плотных контактов участвуют в поддержании целостности эпителиальных структур при длительном механическом воздействии. Теоретическое и практическое значение выполненной работы. В работе предложен новый подход к анализу роли тканевых барьеров в межклеточном взаимодействии, что имеет важное фундаментальное и прикладное значение.

Полученные данные углубляют наши представления о возможных механизмах формирования секрета молочной железы в полости альвеолы. Проведенные исследования позволили обосновать предположение о плотных контактах как функциональном кластере взаимосвязанных белков. Практическая значимость работы определяется возможностью прогноза развития дисфункций молочной железы, связанных с изменением уровня или спектра этих белков в плотных контактах. Результаты диссертации входят в курсы по физиологии, читаемые на биологическом факультете Санкт-Петербургского государственного университета.

Структура диссертационной работы. Структура представленной работы является традиционной. Работа разделена на введение, обзор литературы, главу о методических приемах, 3 главы с результатами исследований и их обсуждением и завершается заключением, выводами и списком цитируемой литературы. Работа изложена на 118 страницах печатного текста, содержит 4 таблицы и иллюстрирована 15-ю рисунками. В списке цитируемой литературы приведено 202 источника (38 отечественных работ и 164 зарубежных). Во введении автором представлена и проанализирована проблема, которую предстоит решить в диссертации. На основании данного анализа сформулированы цель и задачи исследования.

Обоснованы новизна, теоретическое и практическое значение работы. Первая глав» посвящена анализу литературы, в котором достаточно полно представлены направления исследований плотных контактов, их структуры, изучения плотных контактов в эпителии молочной железы, их участии в механизмах межклеточного взаимодействия и роли плотных контактов в парацеллюлярном транспорте. Переходя от традиционных работ в области физиологии молочной железы и анализируя исследования, посвященные барьерным свойствам эпителия альвеол молочной железы, автор рассматривает разные точки зрения в работах по изучению вклада белков плотных контактов в реализацию их функции. Изучив работы, в которых данные получены на линиях клеток, автор логично переходит к работам по изучению плотных контактов в эпителии молочной железы на целостном организме.

Вторая глава содержит обоснование и описание материалов и методов исследования. Экспериментальная часть состояла из двух последовательных этапов. Первый — разработка адекватной модели, и второй — выполнение задач по выявлению спектра, локализации белков плотных контактов в альвеоле и оценки изменений ультраструктуры секреторного эпителия. Применение комплексного методологического подхода, включающего различные морфологические, биохимические и иммунохимические методы, использование сертифицированного экспериментального оборудования и программного обеспечения, в сочетании с достаточным объемом выборки и применением соответствующих статистических критериев, позволило соискателю полностью решить поставленные задачи.

Третья глава включает в себя характеристику плотных контактов в структуре альвеолы молочной железы и анализ результатов проведения Бестернблота и иммуногистохимии, подтвердивших наличие определенной группы клаудинов, их локализацию в эпителии молочной железы. Полученные результаты свидетельствуют, что в период лактации в апикальной части эпителия альвеол молочной железы мышей сформированы плотные контакты, включаннцие в себя клаудины, которые обеспечивают избирательный парацеллюлярный транспорт различных катионов и анионов, а также молекул воды. В четвертой главе обоснован выбор метода накопления секрета в полости альвеолы в течение двадцати часов как адекватной модели для изучения механического воздействия секрета на эпителий молочной железы мьппи.

' Результаты, приведенные в пятой главе, свидетельствуют о том, что при механическом давлении, которое возникает как следствие накопления секрета в полости альвеол„ на апикальную сторону эпителия молочной железы происходит изменение уровня белков плотного контакта, направленное на сохранение целостности ее структуры. Снижение уровня клаудина-2 и -16 по мере накопления секрета может быть адаптивным процессом, направленным на формирование и поддержание ионного состава молока при его накоплении в полости альвеолы молочной железы.

Заключение содержит итоги работы, выводы отражают содержание работы и соответствуют полученным в исследовании результатам. Работа в целом производит положительное впечатление по стилю и логике изложения полученного экспериментального материала, данных литературы и читается с большим интересом. Замечания по диссертации. В подписи к рис.7 не указаны единицы измерения по оси ординат. Имеется неточность в подписи к рис. 11 (следует переставить местами обозначения окклюдина и клаудина). В начале некоторых абзацев главы 5.4 (с.

85 и 89) имеются затрудняющие восприятие незаконченные предложения, фактически являющиеся необозначенными заголовками к последующему тексту. Замечаний по сути работы, существенно влияющих на ее содержание и выводы, нет. В порядке дискуссии хотелось бы услышать мнение диссертанта по некоторым вопросам. 2) Какова роль киназы легких цепей акто-миозинового комплекса в регулировании процесса проницаемости плотных контактов? Заключение. Диссертация Кругловой Натальи Михайловны «Белки плотных контактов секреторного эпителия молочной железы мьппи» представляет собой законченную научно-исследовательскую работу в области молекулярных основ тканевых барьеров и физиологии лактацин.

По своей приоритетности, актуальности, объему проведенных исследований, новизне и практической значимости работа соответствует требованиям и. 9 «Положения о порядке присуждения ученых степеней», утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации от 24.09,2013 г.