Отзыв официального оппонента 2 (Белки плотных контактов секреторного эпителия молочной железы мыши)

Отзыв официального оппонента на диссертацию Кругловой Натальи Михайловны на тему «Белки плотных контактов секреторного эпителия молочной железы мыши»„представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.03.01 — «физиология» В физиологии лактации„в частности в физиологии лактации женщин, существует ряд проблем, для решения которых требуется проведение исследований по анализу клеточных механизмов, лежащих в основе данных процессов. К одной из таких проблем относится лактостаз — прекращение выделения секрета, накопление и его застой в полостной системе молочной железы.

Причины лактостаза хорошо изучены, но клеточные механизмы в результате которых дисфункция процесса переходит в заболевание органа, остаются неизвестными. В этом плане исследование Кругловой Натальи Михайловны представляется весьма актуальным, так как в нем, на модели накопления секрета в полости альвеолы, рассматриваются клеточные процессы, обеспечивающие сохранение структуры альвеолы, являющейся функциональной единицей молочной железы, и механизмы формирования секрета.

В диссертационной работе рассматривается актуальная проблема по изучению вклада белков плотных контактов в сохранение целостности альвеолы молочной железы при механическом растяжении под действием накопления секрета. Сохранение целостности альвеолы в этот момент является необходимым условием для нормального функционирования молочной железы и именно плотные контакты становятся межклеточной структурой, обеспечивающей целостность альвеолы молочной железы при механических воздействиях. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав о методических приемах. В конце каждой главы приводится обсуждение полученных результатов и их сопоставление с имеющимися в литературе данными. В конце диссертации приведено общее заключение, выводы и список литературы. Такое построение работы не противоречит существующему ГОСТУ РФ по написанию диссертационных работ. Наоборот, при большом количестве экспериментального материала и использовании разных методических подходов для решения тех или иных задач такой порядок изложения позволяет понять логику исследований, лучше ориентироваться в полученных данных. Работа изложена на 118 страницах печатного текста, содержит 4 таблицы и иллюстрирована 15 рисунками.

В списке цитируемой литературы приведено 202 источника. Актуальность, цель и задачи исследования, связанные с положениями, выносимыми на защиту ясно изложены во введении. Обоснованы новизна, теоретическое и практическое значение работы. Обширный материал обзора литературы в первой главе дает детальный анализ физиологии молочной железы. Подробно анализируя работы, посвященные физиологическим механизмам регуляции лактации, автор логически переходит к работам по исследованиям барьерных свойств эпителия альвеол молочной железы.

Обзор исследований, в которых было получено функциональное подтверждение того, что для образования секрета в молочной железе необходимо формирование плотных контактов, приводит автора к работам в которых, практически одновременно, на морфологическом и функциональном уровне было сформулировано предположение о возможной роли плотных контактов в обеспечении функций альвеолы молочной железы. Далее автор подробно останавливается на двух направлениях в исследовании барьерных свойств эпителия молочной железы, в которых плотные контакты играют определяющую роль: в первом случае в работах изучали концентрационные и электрические градиенты в самом органе или в альвеоле.

Во-вторых, сравнивали концентрацию различных соединений и ионов в плазме крови и молоке в разные стадии лактации или при различных воздействиях. В том и другом случае делали заключение о важной роли плотных контактов. Изучение работ, связанных с исследованиями плотных контактов в эпителии молочной железы на целостном организме и работ посвященных изменению уровня клаудинов в процессе дифференцировки ткани молочной железы при беременности, лактации и инволюции логически подводит к формулированию основных задач исследования и позволяет оценить роль плотных контактов в поддержании целостности эпителиальных структур. Во второй главе подробно описаны материалы и методы исследования.

Подготовка и обработка экспериментального материала, определение белков плотных контактов методом Вестерн-блот, изучение препаратов ткани молочной железы с помощью световой и электронной микроскопии, использование иммуногистохимии для изучения локализации белков плотных контактов, все это можно оценить, как методы, адекватные поставленной задаче. Характеристика как структуры плотных контактов в альвеолах молочной железы, так и спектра клаудинов в ней, приведена в третьей главе На основании полученных результатов, автор делает обоснованное заключение о том, что физиологические условия осуществления секреции и выведения молока должны определяться различными белками семейства клаудинов, участвующих в формировании тканевого барьера, а результаты изучения клаудинов, как основных белков плотных контактов в альвеолах молочной железы — это возможность прогноза развития дисфункций этого органа, связанных с изменением уровня или спектра этих белков в плотных контактах.

В четвертой главе, на основании данных электронной микроскопии, показавших изменения ультраструктуры эпителиальных клеток после длительного перерыва в кормлении, а также используя активность миелопероксидазы, как маркера местного воспалительного процесса, доказавшей, что перерыв в кормлении детенышей не приводит к развитию воспалительных процессов в ткани молочной железы, был сделан обоснованный выбор метода накопления секрета в полости альвеолы в течение двадцати часов, как адекватной модели для изучения механического воздействия секрета на эпителий молочной железы мыши.

Результаты экспериментов, приведенные в пятой главе, свидетельствуют о том, что длительный перерыв в кормлении детенышей оказывает влияние на уровень, локализацию клаудинов и длину плотных контактов в молочной железе мыши, но не приводит к разрушению плотных контактов, целостность эпителиального барьера остается не нарушенной. При механическом давлении, которое возникает как следствие накопления секрета в полости альвеол, на апикальную сторону эпителия молочной железы, происходит изменение уровня белков плотного контакта, направленное на сохранение целостности ее структуры. А снижение уровня клаудина-2 и -1б по мере накопления секрета может быть адаптивным процессом, направленным на формирование и поддержание ионного состава молока при его накоплении в полости альвеолы молочной железы.

Заключение содержит итоги работы, выводы отражают содержание работы и соответствуют полученным в исследовании результатам. Замечания по диссертации. Есть один уточняющий вопрос по методике проведения морфометрических исследований. Хотелось бы уточнить, что принималось за отдельное событие для статистического анализа параметров гистологической структуры альвеол молочной железы". К недочетам работы также можно отнести некоторые неточные формулировки, которые, впрочем, не меняют основное содержание и смысл работы. Существенных замечаний по диссертации нет. Подробный анализ научной литературы, который продемонстрировал глубокое понимание Н.М. Кругловой проблем физиологии лактации и физиологии тканевых барьеров, позволил автору корректно сформулировать цели и задачи исследовании, направленные на изучение вклада белков плотных контактов в сохранение структуры эпителиального пласта и условий формирования секрета в полости альвеолы молочной железы.

Благодаря применению электронной микроскопии, морфометрических и молекулярно-биологических методов, были получены результаты, включающие данные, обладающие несомненной научной новизной. Впервые показано, что накопление секрета в полости альвеол молочной железы влияет на уровень клаудинов, изменяющих межклеточную проницаемость эпителия и сохраняющих целостность альвеол молочной железы. Впервые установлено„ что перерыв в кормлении на протяжении двадцати часов не вызывает развития воспалительных процессов в эпителии молочной железы.

Являются новыми данные о снижении уровня клаудина-2 и -16 при накоплении секрета в полости альвеолы молочной железы. Получены принципиально новые результаты, показывающие увеличение уровня клаудина-1 и -3 при механическом воздействии на секреторный эпителий. Теоретическое и практическое значение выполненной работы.

Полученные данные расширяют наши представления о механизмах формирования секрета молочной железы в полости альвеолы. Экспериментально доказано, что плотные контакты вносят свой вклад в поддержание целостности эпителиальных структур при длительном механическом воздействии. Практическая значимость работы состоит в том„ что существует возможность прогноза развития дисфункций молочной железы, связанных с изменением уровня или спектра этих белков в плотных контактах, что, в свою очередь, может быть использовано для разработки практических рекомендаций в области маммологии.

Профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом гинекологии детского возраста ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, С.Н.Гайдуков .;6; з/ доктор медицинских наук 194100, г. Санкт- Петербург, ул. Литовская, д.2 Тел.

(8 1 2) 524-95-92 эл. адрес: з~Ь~к ~та щ 28 апреля 2618 г Заключение. Диссертация Кругловой Натальи Михайловны «Белки плотных контактов секреторного эпителия молочной железы мыши» представляет собой законченную научно-исследовательскую работу в области молекулярных основ тканевых барьеров и физиологии лактации. По своей приоритетности, актуальности, объему проведенных исследований, новизне и практической значимости работа соответствует требованиям п.9 «Положения о порядке присуждения ученых степеней», утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации от 24. 09. 2013г.

№ 842 (редакция от 21.04. 20!6 г, № 335) предъявляемым к диссертациям на соискание ученой степени кандидата биологических наук, а ее автор, Круглова Наталья Михайловна, достойна присуждения степени кандидата биологических наук по специальности 03.03.0! — физиология.

.