Автореферат (Влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета), страница 3

Участиециклооксигеназного пути метаболизма АК в действии глутоксима и моликсанана [Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы исследовано с использованиемструктурно различных ингибиторов циклооксигеназ индометацина иацетилсалициловойкислоты(аспирина)–нестероидныхпротивовоспалительных агентов. Показано, что предварительная инкубациямакрофагов в течение 5 мин с 20 мкМ индометацина или 100 мкМ аспиринавызывает значительное уменьшение фазы мобилизации Са2+ извнутриклеточных депо и фазы входа Са2+, индуцированных 100 мкг/млглутоксима или 100 мкг/мл моликсана.Кроме того, показано, что добавление 40 мкМ индометацина или 100 мкМаспирина на фоне развившегося входа Са2+, индуцируемого 100 мкг/млглутоксима, приводит к значительному подавлению входа Са2+ в макрофагах.

Всреднем подавление входа Са2+, вызываемого глутоксимом, составило дляаспирина 26,2±3,3% (по данным 8 экспериментов), для индометацина 56,8±4,7% (по данным 9 экспериментов). Аналогичные результаты получены дляпрепарата моликсан.На основании полученных данных можно предположить, чтоциклооксигеназы и/или продукты циклооксигеназного пути метаболизма АКиграют важную роль в запуске мобилизации Са2+ из депо, а также в генерации и12поддержании депо-зависимого входа Са2+, индуцируемых глутоксимом илимоликсаном в макрофагах.Влияние ингибиторов липоксигеназ на Са2+-ответы, вызываемыеглутоксимом и моликсаном в макрофагах. Для выявления возможногоучастия липоксигеназного пути окисления АК во влиянии глутоксима имоликсана на [Ca2+]i в макрофагах использовали широкий спектрфармакологических агентов:1) неселективный ингибитор липоксигеназ нордигидрогуаретиковаякислота (НДГК);2) селективный ингибитор 5-липоксигеназ каффеиковая кислота;3) селективный ингибитор 5-липоксигеназ зилеутон, используемый втерапии бронхиальной астмы;4) селективный ингибитор 12-липоксигеназ флавоноид байкалейн.Было показано, что предварительная инкубация макрофагов с 1 мкМзилеутона, 5 мкМ НДГК, 5 мкМ каффеиковой кислоты или 5 мкМ байкалейна втечение 5 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима вызывает значительноеподавление мобилизации и депо-зависимого входа Са2+, индуцируемыхглутоксимом.

Так, для зилеутона подавление мобилизации Са2+ составило79,2±9,1%, а подавление входа Са2+ - 58,7±8,4% (в среднем по данным 7экспериментов). Аналогичные результаты получены для препарата моликсан.Исследовано также влияние ингибиторов липоксигеназ на развившийсявход Са2+, индуцируемый 100 мкг/мл глутоксима или моликсана вперитонеальных макрофагах крысы. Установлено, что введение НДГК (30 мкМ),каффеиковой кислоты (40 мкМ), зилеутона (4 мкМ) или байкалейна (40 мкМ) нафоне развившегося входа Са2+ вызывает подавление входа Са2+, вызываемогоглутоксимом или моликсаном, с различной эффективностью.

В среднемподавление входа Са2+, вызываемого глутоксимом, составило для НДГК - 31,7 ±5,8% (по данным 7 экспериментов), для каффеиковой кислоты - 31,2 ± 9,1% (поданным 8 экспериментов), для зилеутона 41,8 ± 9,3% (по данным 11экспериментов), для байкалейна - 60,5 ± 8,9% (по данным 7 экспериментов).Аналогичные результаты получены для препарата моликсан.Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что 5и 12-липоксигеназы или продукты окисления АК с участием этих ферментовиграют важную роль в формировании обеих фаз Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом или моликсаном.Влияние ингибиторов эпоксигеназ на Са2+-ответы, индуцируемыеглутоксимом и моликсаном в макрофагах.

Для исследования возможногоучастия эпоксигеназного пути окисления АК в действии глутоксима и моликсанана [Ca2+]i в макрофагах использовали два структурно различных ингибитора13эпоксигеназ:проадифен(соединениеSKF525A)иэконазол–антимикотический агент имидазольной природы.Установлено, что предварительная инкубация клеток с 100 мкМпроадифена в течение 5 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима приводит кпрактически полному подавлению как фазы мобилизации Са2+ из депо (в среднемпо данным 7 экспериментов на 95,6±6,3%), так и фазы входа Са2+ (в среднем поданным 7 экспериментов на 92,3±5,7%), вызываемых глутоксимом.Аналогичные результаты получены при использовании 100 мкг/мл моликсана.При предварительной инкубации макрофагов с 5 мкМ эконазола в течение 5 миндо введения 100 мкг/мл моликсана также происходит практически полноеподавление фазы мобилизации Са2+ из депо (в среднем по данным 7экспериментов на 87,1±5,8%) и подавление входа Са2+ (в среднем по данным 7экспериментов на 32,3±4,9%), вызываемых моликсаном.

Сходные данныеполучены при использовании 100 мкг/мл глутоксима.Показано также, что добавление 100 мкМ проадифена или 5 мкМэконазола на фоне развившегося входа Са2+, индуцируемого глутоксимом илимоликсаном, приводит к существенному подавлению входа Са2+ вперитонеальные макрофаги крысы. В среднем подавление входа Са2+,вызвываемого глутоксимом, составило для проадифена 37,5 ± 4,2% (по данным5 экспериментов), а для эконазола – 35,8 ± 5,0% (по данным 6 экспериментов).Подавление входа Са2+, вызываемого моликсаном, в среднем составило дляпроадифена 38,1 ± 3,9 % (по данным 5 экспериментов), а для эконазола – 21,8 ±4,3 % (по данным 6 экспериментов).Полученные результаты позволяют предположить, что эпоксигеназы илипродукты эпоксигеназного пути метаболизма АК участвуют в регуляции Са2+ответов, индуцируемых глутоксимом или моликсаном в макрофагах.В то же время установлено, что ингибиторы эпоксигеназ сами могутиндуцировать Са2+-ответы в клетках.

Так, проадифен (100 мкМ) вызывает вбескальциевой среде постепенно нарастающее повышение [Ca2+]i, связанное, повидимому, с мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо в перитонеальныхмакрофагах крысы. Последующее введение в наружную среду 2 мМ Са2+активирует вход Са2+ в макрофаги. Кроме того, проадифен и эконазол вызываютнебольшое увеличение [Ca2+]i (в среднем по данным 14 экспериментов на13,6±2,4% относительно базального уровня) до введения глутоксима илимоликсана.В связи с этим можно предположить, что подавление проадифеном иэконазолом мобилизации Са2+ из депо, индуцированной глутоксимом илимоликсаном, может быть связано с тем, что к моменту введения глутоксима или14моликсана депо уже были частично опустошены приложением проадифена илиэконазола.Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, чтоодним из важных участников сигнального каскада, запускаемого глутоксимом имоликсаном в макрофагах, является каскад метаболизма АК, причём во влиянииглутоксима и моликсана на [Ca2+]i задействованы все три пути окисления АК –циклооксигеназный, липоксигеназный и эпоксигеназный.

Кроме того,полученные данные указывают на нежелательность совместного клиническогоприменения глутоксима и моликсана и лекарственных препаратов на основеингибиторов ФЛА2, циклооксигеназ, липоксигеназ и эпоксигеназ.Влияние ингибиторов актин-связывающих белков на Са2+-ответы,вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах. Для исследованиявозможного участия Arp2/3-комплекса и белков семейства WASP (Wiskott–Aldrich Syndrome proteins; белки синдрома Вискотта - Олдрича) в действииглутоксима и моликсана на [Ca2+]i использовали ингибитор Arp2/3-комплексасоединение СК-0944666 и ингибитор белков WASP вискостатин.Впервые обнаружено, что предварительная инкубация макрофагов с 100мкМ СК-0944666 в течение 1 ч до введения 100 мкг/мл моликсана или 100 мкг/млглутоксима вызывает практически полное подавление обеих фаз Са2+-ответов,индуцированных этими агентами.

В среднем (по данным 7 экспериментов длякаждого из препаратов) подавление мобилизации Са2+ из депо составило 88,9 ±5,2% и 86,7 ± 5,0%, а входа Са2+ - 91,1 ± 6,7% и 89,3 ± 6,2% для моликсана иглутоксима соответственно.Кроме того, впервые показано, что предварительная инкубациямакрофагов с 30 мкМ вискостатина в течение 15 мин до введения 100 мкг/млглутоксима приводит к существенному подавлению как фазы мобилизации Са2+из депо (в среднем на 57,6 %), так и фазы входа Са2+ (в среднем на 71,2 %) (рис.2б). Введение 40 мкМ вискостатина во время уже развившегося входа Са2+,индуцированного глутоксимом, вызывало существенное подавление (в среднемна 42,3 %) входа Са2+ (рис.

2а). Аналогичные данные получены с применением100 мкг/мл моликсана.Таким образом, впервые выявлено участие Arp2/3 комплекса и белковWASP - ключевых регуляторов полимеризации актина – во влиянии глутоксимаи моликсана на [Ca2+]i в макрофагах. Полученные данные свидетельствуют о том,что элементы актинового цитоскелета являются активными участникамипроцессов Са2+-сигнализации в макрофагах. Эти результаты подтверждаютболее ранние данные о том, что для генерации увеличения [Са2+]i в ответ наглутоксим и моликсан необходимы динамичные перестройки актиновогоцитоскелета (Курилова и др., 2012; Kurilova et al., 2013).15Рисунок 2.