Автореферат (1145902), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Влияние вискостатина на увеличение [Ca2+]i, вызываемоеглутоксимом в макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 1.а – клетки инкубировали с 100 мкг/мл глутоксима в течение 20 мин вноминально бескальциевой среде, затем вход Са2+ инициировали введением 2 мМСа2+ в наружную среду; на фоне развившегося входа Са2+ вводили 40 мкМвискостатина.б – клетки предварительно инкубировали в номинально бескальциевойсреде с 30 мкМ вискостатина в течение 15 мин до введения 100 мкг/млглутоксима, через 20 мин после введения глутоксима вход Са2+ инициироваливведением в наружную среду 2 мМ Са2+.16ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящей работе впервые показано, что ферменты и продукты каскадаметаболизма АК играют важную роль в запуске и регуляции Са2+-ответов,вызываемых глутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы.Так, с использованием структурно-различных ингибиторов ФЛА2 установлено,что эти ферменты необходимы для формирования обеих фаз увеличения [Са2+]i,вызываемого глутоксимом и моликсаном.
В экспериментах с применениемширокого спектра ингибиторов циклооксигеназ, липоксигеназ и цитохром Р450подобных эпоксигеназ впервые показано участие циклооксигеназного,липоксигеназного и эпоксигеназного путей метаболизма АК в действииглутоксима и моликсана на [Са2+]i в перитонеальных макрофагах крысы. Крометого, полученные результаты указывают на нежелательность совместногоклинического применения лекарственных средств на основе ингибиторовкаскада метаболизма АК с препаратами глутоксим и моликсан.Впервые выявлено также, что во влиянии глутоксима и моликсана на2+[Са ]i в макрофагах важную роль играют актин-связывающие белки,запускающие рост и ветвление актиновых филаментов. Так, с использованиемспецифического ингибитора белков WASP вискостатина и специфическогоингибитора Arp 2/3-комплекса соединения СК-0944666 показано участие этихбелков в формировании Са2+-ответов, вызываемых глутоксимом и моликсаном вмакрофагах.На основании результатов, полученных в настоящей работе и ранее, атакже данных литературы можно предположить следующую модель участиякаскада метаболизма АК и элементов актинового цитоскелета во влияниииммуномодуляторов на основе GSSG на [Са2+]i в перитонеальных макрофагахкрысы (рис.
3).Вероятно, воздействие глутоксима или моликсана приводит ктрансактивации рецепторов, связанных с гетеротримерными G-белками, ирецепторных тирозинкиназ в плазматической мембране макрофагов. При этомпроисходит запуск фосфоинозитидного пути передачи сигналов и мобилизацияСа2+ из внутриклеточных Са2+-депо.
Сигнал об опустошении депо передаётсяСа2+-каналам в плазмалемме по депо-зависимому механизму, что приводит квходу Са2+ в клетки. Кроме того, при действии глутоксима и моликсана вмакрофагах, вероятно, происходит запуск каскада метаболизма АК: активацияфосфолипаз А2 и продукция большого количества АК, а также активацияциклооксигеназ, липоксигеназ и эпоксигеназ, которые окисляют АК собразованием широкого спектра эйкозаноидов.17Эйкозаноиды, в свою очередь, выступают в роли посредников в действииглутоксима и моликсана на [Са2+]i.
Так, эти соединения могут непосредственномодулировать активность ионных каналов, участвующих в процессах Са2+сигнализации, запускаемых глутоксимом или моликсаном. Кроме того, участиециклооксигеназного и липоксигеназного путей может быть опосредовановлиянием на элементы актинового цитоскелета (актин-связывающие белкиWASP и комплексы белков Arp2/3) и на перестройки актиновых филаментов.Интактные, способные к реорганизации актиновые филаменты, в свою очередь,необходимы для генерации Са2+-ответов, индуцируемых глутоксимом имоликсаном в перитонеальных макрофагах крысы.
Реорганизациякортикального слоя актина, по-видимому, необходима для передачи сигнала отрецепторов плазмалеммы к внутриклеточным Са2+-депо и развития мобилизацииСа2+ из депо. Кроме того, актиновые филаменты участвуют в активации депозависимого входа Са2+, согласно модели «связывания по типу секреции»(secretion-like coupling model) (Rosado, Sage, 2000; Курилова и др., 2006, 2007).Ферменты и продукты эпоксигеназного пути метаболизма АК такжеиграют важную роль в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в макрофагах.Однако механизмы участия эпоксигеназного пути окисления АК мало изучены.Существуют данные о том, что эпоксигеназы или их продукты активируют депозависимые Са2+-каналы, выступая в качестве факторов входа Са2+, или участвуютв активации фосфатидилинозитолкиназ и малых G-белков суперсемейства Ras,которые также играют важную роль в перестройках актиновых филаментов(Muthalif et al., 1998; Chen et al., 2001; Wang et al., 2005).Таким образом, в настоящей работе выявлены новые участникисигнального каскада, запускаемого глутоксимом и моликсаном и приводящего кувеличению [Са2+]i в перитонеальных макрофагах крысы: каскад метаболизмаАК и элементы актинового цитоскелета - актин-связывающие белки WASP икомплекс белков Arp2/3.
Однако тонкие биофизические механизмы участия этихсистем в действии глутоксима и моликсана на макрофаги остаются предметомдля дальнейших исследований.Рисунок 3 (см. на стр. 19)1819Рисунок 3. Возможные механизмы влияния глутоксима и моликсанана внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах: участие каскадаметаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелетаГлутоксим и моликсан вызывают трансактивацию рецепторнойтирозинкиназы или пуринергического рецептора P2Y2-типа, связанного сгетеротримерным G-белком (G), что приводит к запуску фосфоинозитидногопути передачи сигнала с участием фосфолипазы Сγ (ФЛCγ) или β (ФЛCβ).
ФЛCрасщепляют фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (PIP2) на два вторичныхпосредника: инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3) и диацилглицерол (ДАГ). IP3активирует IP3-рецепторы, в результате чего происходит выход Са2+ извнутриклеточных Са2+-депо. Сигнал об опустошении Са2+ депо передаётся депозависимым Са2+-каналам в плазмалемме, и происходит депо-зависимый входСа2+ в клетку.ДАГ активирует протеинкиназу С (ПКС), которая, в свою очередь,вызывает активацию фосфолипаз А2 (ФЛA2) и циклооксигеназ (ЦОГ).
Крометого, глутоксим и моликсан могут запускать тиол-дисульфидный обмен междуостатками цистеина (Cys) в трансмембранных белках, что приводит к снижениюсоотношения концентраций восстановленного и окисленного глутатиона(GSH/GSSG) и слабому окислительному стрессу. Изменение редокс-статуса вцитозоле также может активировать ферменты каскада метаболизмаарахидоновой кислоты.ФЛA2 высвобождает арахидоновую кислоту (АК) из мембранныхлипидов.
Далее АК окисляется с участием циклооксигеназ (ЦОГ), липоксигеназ(ЛОГ) и цитохром Р450-подобных эпоксигеназ (Цит Р450) с образованиемразличных эйкозаноидов. Продукты метаболизма АК регулируют какмобилизацию Са2+ из депо, так и последующий депо-зависимый вход Са2+,вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах. Так, эйкозаноиды могутнепосредственно влиять на активность IP3-рецепторов и депо-зависимых Са2+каналов или регулировать перестройки актинового цитоскелета с участиембелков WASP и Arp 2/3-комплекса. Динамичная реорганизациямикрофиламентов необходима для формирования обеих фаз Са2+-ответов,индуцируемых препаратами глутоксим и моликсан.20ВЫВОДЫ1.
Ингибиторы фосфолипаз А2 (4-бромфенацилбромид, дексаметазон ипреднизолон) практически полностью подавляют мобилизацию Са2+ извнутриклеточных Са2+-депо и последующий депо-зависимый вход Са2+,индуцируемые глутоксимом или моликсаном в перитонеальных макрофагахкрысы.2. Структурно различные ингибиторы циклооксигеназ (индометацин,ацетилсалициловая кислота), липоксигеназ (нордигидрогуаретиковая кислота,каффеиковая кислота, зилеутон, байкалейн) и эпоксигеназ (эконазол, проадифен)подавляют обе фазы Са2+-ответов, вызываемых глутоксимом или моликсаном.Введение этих фармакологических агентов на фоне развившегося депозависимого входа Са2+, индуцируемого глутоксимом или моликсаном, приводитк подавлению входа Са2+ в макрофаги.3.
Ингибиторы Arp 2/3-комплекса (соединение СК-0944666) и белковWASP (вискостатин) практически полностью подавляют Са2+-ответы,индуцируемые глутоксимом и моликсаном, что позволяет предположить участиепроцесса сборки актиновых филаментов в действии глутоксима и моликсана навнутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах.4. Полученные данные свидетельствуют о том, что в сигнальном каскаде,запускаемом глутоксимом и моликсаном и приводящем к увеличениювнутриклеточной концентрации Са2+ в макрофагах, участвуют важнейшие путиокисления арахидоновой кислоты (циклооксигеназный, липоксигеназный,эпоксигеназный), а также элементы актинового цитоскелета (белки WASP и Arp2/3-комплекс).5. Результаты также указывают на нежелательность совместногоклинического применения глутоксима и моликсана с медицинскимипрепаратами на основе ингибиторов каскада метаболизма арахидоновойкислоты.21СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИМонографии:1.
Krutetskaya Z.I., Milenina L.S., Melnitskaya A.V., Naumova A.A.,Antonov V.G. Redox modulation of Ca2+ and Na+ transport in nonexitable cells// St.Petersburg State Polytechnical University Publishing House. – 2014. – 171 р.Статьи в рецензируемых журналах:1. Курилова Л.С., Крутецкая З.И., Наумова А.А., Бутов С.Н., КрутецкаяН.И., Антонов В.Г. Влияние ингибиторов циклооксигеназ и липоксигеназ наСа2+-ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах// Цитология.- 2014. - Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
