Автореферат (1145902), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Материалы, представленные в диссертации, былидоложены на: VIII и IX Международной конференции «Биоантиоксидант»(Москва, 2010, 2015); VIII, Х и XI Международном симпозиуме «BiologicalMotility: Fundamental and Applied Science» (Пущино, 2012, 2014, 2016);Международном симпозиуме по проблемам боли «Translational approaches tocause-oriented treatment of pain symptoms» (Санкт-Петербург, 2012);Международной междисциплинарной научной конференции «Биологическиактивные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросыполучения и применения» (Новый Свет, Крым, 2013); Всероссийскомсимпозиуме и школе-конференции для молодых учёных по биологии клетки вкультуре (Санкт-Петербург, 2013); XXII Съезде Физиологического обществаимени И.П.
Павлова (Москва – Волгоград, 2013); Международной научнометодической конференции «Современные проблемы биофизики сложныхсистем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013);Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы иантиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013); V, VI, VII,VIII, IX Международной научно-практической конференции «Высокиетехнологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии имедицине» (Санкт-Петербург, 2013, 2014, 2015); 18 и 19 МеждународнойПущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века»(Пущино, 2014, 2015); Международной конференции молодых учёных«Экспериментальная и теоретическая биофизика 2014» (Пущино, 2014); IIВсероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт,цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2015); Международной конференции«Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015); V Съездебиофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015); 40 Конгрессе Федерации7Европейских биохимических обществ (40th FEBS Congress) (Германия, Берлин,2015).Публикации.
По теме диссертации опубликовано 30 научных работ, втом числе 1 монография, 6 статей в рецензируемых журналах, 11 статей и 12тезисов в материалах конференций.Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на169 страницах; включает такие разделы, как введение, обзор литературы,материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, общеезаключение, выводы и список литературы, включающий 296 наименований.Работа иллюстрирована 55 рисунками и 2 таблицами.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯОбъектом исследования служили культивируемые резидентныеперитонеальные макрофаги крыс линии Wistar.
Клетки выделяли изперитонеальной полости крыс (самцов массой 200 - 300 г) по методу, описанномуранее (Conrad, 1981; Randriamampita, Trautmann, 1987). Сразу после выделенияклетки имели сферическую форму и диаметр около 10 - 20 мкм. Суспензиюклеток помещали в бакпечатки с кварцевыми стеклами (10 х 10 мм). Клетки настеклах культивировали в среде 199 (рН 7,2) с добавлением сыворотки кровибыка (20%), раствора глутамина (3%), пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина(100 мг/мл) в течение 1 – 3 суток при 37°С. По окрашиванию αнафтилацетатэстеразой (Monahan et al., 1981) было определено, что по меньшеймере 96% клеток в монослоях являются макрофагами.
Эксперименты проводилипри комнатной температуре 20 - 22°С на 2-е - 3-и сутки культивирования.Растворы. Кварцевые стекла с клетками помещали в экспериментальнуюкамеру, заполненную физиологическим раствором следующего ионного состава:NaCl – 140 мМ, КСl – 5 мМ, CaCl2 – 1 мМ, MgCl2 – 1 мМ, HEPES-NaOH - 5 мМ;рН 7,3 - 7,4 (Alonso-Torre, Trautmann, 1993). Бескальциевая среда содержала 0мМ СаС12 и 1 мМ ЭГТА.Маточные растворы глутоксима (50 мг/мл) и моликсана (50 мг/мл)(«ФАРМА-ВАМ», Санкт-Петербург) готовили на воде.
Маточные растворыацетилсалициловой кислоты (10 мМ), каффеиковой кислоты (5 мМ) ибайкалейна (5 мМ) («Sigma-Aldrich», США) готовили на этиловом спирте.Маточные растворы 4-бромфенацилбромида (10 мМ), индометацина (10 мМ),нордигидрогуаретиковой кислоты (10 мМ), зилеутона (1 мМ), эконазола (5 мМ),проадифена (100 мМ), вискостатина (10 мМ), соединения СК-0944666 (100 мМ)и Fura-2AM (1 мМ) («Sigma-Aldrich», США) готовили на диметилсульфоксиде.8В экспериментах также использовали коммерческие препараты дексаметазона(«KRKA», Словения) и преднизолона («Takeda Austria GmbH», Австрия).Измерение внутриклеточной концентрации Са2+ с помощьюфлуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM. Для измерения [Ca2+]i использовалифлуоресцентный зонд Fura-2AM.
Макрофаги инкубировали в течение 45 мин вфизиологическом растворе, содержащем 2 мкМ Fura-2AM, при комнатнойтемпературе (20 - 22°С). Стекла с окрашенными клетками отмывалифизиологическим раствором и переносили в экспериментальную камеру,расположенную на предметном столике люминесцентного микроскопа.Для выявления и усиления входа Са2+ в клетки в ходе регистрации [Ca2+]iиспользовали классическую схему эксперимента (Са2+-free/ Са2+-reintroductionprotocol) (Alonso-Torre, Trautmann, 1993). Макрофаги инкубировали вноминально бескальциевой среде; затем на них действовали глутоксимом илимоликсаном, вызывая мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. Последобавления в наружную среду 2 мМ Са2+ и восстановления физиологическогоградиента концентрации Са2+ наблюдалось быстрое повышение [Ca2+]i,отражающее вход Са2+ в клетку.
Фармакологические агенты добавляли довведения глутоксима или моликсана (предварительная инкубация) или во времяразвившегося входа Са2+ из наружной среды.Экспериментыпроводилисиспользованиеморигинальнойавтоматизированной экспериментальной установки на базе флуоресцентногомикроскопа Leica DM 4000B («Leica Microsystems», Германия).Экспериментальная установка на базе флуоресцентного микроскопаLeica DM 4000B.
Возбуждение флуоресценции объекта производили при длинахволн 340 и 380 нм через объектив 10× с апертурой 8 мм флуоресцентногомикроскопа. Источником возбуждающего излучения служила ксеноновая лампа(75 Вт). Эмиссию регистрировали при длине волны 510 нм с помощьюспециализированной видеокамеры Leica DFC340FX. Для выделениясоответствующих участков спектра использовали узкополосные оптическиефильтры. Для управления экспериментом использовали систему обработкиизображения ImageJ (плагин Micro-Manager 1.4). Для избежания фотовыгоранияизмерения проводили через каждые 20 с, облучая объект в течение 2 с.Значения [Ca2+]i рассчитывали по уравнению Гринкевича (Grynkiewicz etal., 1985). Статистический анализ проводили с применением критерия tСтьюдента.
На рисунках приведены результаты типичных экспериментов.Данные представлены в виде графика изменения отношения интенсивностейфлуоресценции Fura-2AM при длинах волн возбуждающего излучения 340 и 380нм (отношение F340/F380) во времени, отражающего динамику изменения [Ca2+]i вклетках в зависимости от времени измерения (Xie et al., 2002).9РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВлияние препаратов глутоксим и моликсан на внутриклеточнуюконцентрацию Са2+ в макрофагах.
В контрольных экспериментах исследовановлияние препаратов глутоксим и моликсан на [Ca2+]i в резидентныхперитонеальных макрофагах крысы.Было показано, что инкубация макрофагов в течение 20 - 23 мин с 100мкг/мл моликсана (рис. 1а) или 100 мкг/мл глутоксима (рис. 2а) в бескальциевойсреде вызывает медленно нарастающее увеличение [Ca2+]i, отражающеемобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. В среднем (по данным 6экспериментов для каждого из препаратов) через 20 - 23 мин после добавленияагентов [Ca2+]i увеличивается от базального уровня, равного 91 ± 16 нМ, до 161± 20 нМ для глутоксима и до 153 ± 19 нМ - для моликсана.
При введении в среду2 мМ Са2+ наблюдается дальнейшее повышение [Ca2+]i, отражающее вход Са2+ вцитозоль. В среднем (по данным 6 экспериментов для каждого из препаратов)увеличение [Ca2+]i во время входа Са2+ составило 259 ± 18 нМ и 255 ± 21 нМ дляглутоксима и моликсана соответственно. Таким образом, оба препаратаоказывают сходное влияние на [Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы.Влияние ингибиторов фосфолипазы А2 на Са2+-ответы, вызываемыеглутоксимом и моликсаном в макрофагах. Запуск каскада метаболизма АК сучастием ФЛА2 является одним из ключевых событий в активации макрофагов.
Всвязи с этим представлялось целесообразным исследовать участие ключевого(«стартового») фермента каскада – ФЛА2 – во влиянии препаратов глутоксим имоликсан на [Са2+]i в перитонеальных макрофагах крысы. Для достижения этойцели использовали три структурно-различных ингибитора ФЛА2: 4бромфенацилбромид (4-БФБ), а также глюкокортикоиды дексаметазон ипреднизолон – стероидные противовоспалительные и антиаллергические агенты.Впервые показано, что преинкубация клеток с 20 мкМ 4-БФБ в течение 15мин до введения 100 мкг/мл моликсана приводит к подавлению как мобилизацииСа2+ из депо (в среднем по данным 7 экспериментов на 71,7 ± 4,7%), так ипоследующего входа Са2+ в клетку (в среднем по данным 7 экспериментов на 72,6± 5,1%), вызываемых моликсаном (рис. 1б).
Сходные данные были получены вопытах по влиянию 4-БФБ на Са2+-ответы, индуцируемые 100 мкг/мл глутоксима.10Рисунок 1. Влияние ингибиторов фосфолипазы А2 на увеличение[Ca ]i в перитонеальных макрофагах крысы, вызываемое моликсаномЗдесь и далее на рис. 2 по оси ординат – отношение интенсивностейфлуоресценции Fura-2AM F340/F380 при длинах волн возбуждающего излучения340 и 380 нм соответственно (относительные единицы, отн. ед.), по оси абсцисс– время (мин). Каждая регистрация получена для группы из 40 – 50 клеток ипредставляет собой типичный вариант для 6 - 7 экспериментов.а – клетки инкубировали в течение 20 мин в присутствии 100 мкг/млмоликсана в номинально бескальциевой среде, затем вход Са2+ индуцироваливведением в наружную среду 2 мМ Са2+;б, в, г – клетки предварительно инкубировали в течение 15 мин с 20 мкМ4-бромфенацилбромида (б), в течение 10 мин с 8 мкг/мл дексаметазона (в), втечение 16 мин с 25 мкг/мл преднизолона (г) в бескальциевой среде, затемдобавляли 100 мкг/мл моликсана, через 20 мин вход Са2+ инициироваливведением в наружную среду 2 мМ Са2+.2+11Показано также, что преинкубация клеток с 8 мкг/мл дексаметазона втечение 10 мин до введения 100 мкг/мл моликсана вызывает практически полноеподавление вызываемых моликсаном мобилизации Са2+ из депо (в среднем поданным 7 экспериментов на 85,4 ± 5,9 %) и последующего входа Са2+ в цитозоль(в среднем по данным 7 экспериментов на 89,6 ± 6,2%, рис.
1в).Предварительная инкубация макрофагов с 25 мкг/мл преднизолона втечение 16 мин до введения 100 мкг/мл моликсана также приводит к подавлениюмобилизации Са2+ из депо (в среднем по данным 7 экспериментов на 73,8 ± 4,8%)и входа Са2+ (в среднем по данным 7 экспериментов на 71,4 ± 5,3%),индуцированных моликсаном (рис. 1г). Сходные данные получены прииспользовании 100 мкг/мл глутоксима.Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об участииФЛА2 и каскада метаболизма АК в запуске Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах. При этомрассмотренный нами эффект глюкокортикоидов обусловлен, по-видимому, негеномными эффектами, характерными для стероидных гормонов, а их быстрым(в течение 10 – 15 мин) действием на ФЛА2 в макрофагахВлияние ингибиторов циклооксигеназ на увеличение [Са2+]i,индуцируемое глутоксимом и моликсаном в макрофагах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
