Автореферат (Влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета)

На правах рукописиНаумова Александра АндреевнаВЛИЯНИЕ ГЛУТОКСИМА И МОЛИКСАНАНА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+В МАКРОФАГАХ:РОЛЬ КАСКАДА МЕТАБОЛИЗМА АРАХИДОНОВОЙКИСЛОТЫ И АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА03.01.02 - биофизикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание учёной степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20172Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультетаФедерального государственного бюджетного учреждения высшего образования«Санкт-Петербургский государственный университет».Научный руководитель:Официальные оппоненты:Ведущее учреждение:Крутецкая Зоя Иринарховна,докторбиологическихнаук,профессор,заведующаякафедройбиофизикибиологического факультета ФГБОУ ВО «СанктПетербургский государственный университет».Шпаков Александр Олегович,доктор биологических наук, заведующийлабораторией молекулярной эндокринологии инейрохимии ФГБУН «Институт эволюционнойфизиологии и биохимии им.

И.М. Сеченова»Российской Академии наук (ИЭФБ РАН).Плахова Вера Борисовна,кандидат биологических наук, старший научныйсотрудник лаборатории физиологии возбудимыхмембран ФГБУН «Институт физиологии им.И.П. Павлова» Российской Академии наук (ИФРАН).Федеральноегосударственноебюджетноевоенное образовательное учреждение высшегообразования «Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова»МинистерстваобороныРоссийской Федерации.Защита состоится «25» мая 2017 года в 14 часов 00 минут на заседанииДиссертационного совета Д 212.232.10 по защите докторских и кандидатскихдиссертаций на базе ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственныйуниверситет», по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.

д. 7/9,ауд. № 90.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М. ГорькогоФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» по адресу:199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. д. 7/9, а также на сайте СанктПетербургского государственного университета по адресу:https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/41cJd9x1Q6.pdf.Автореферат разослан «_____» ______________ 2017 года.Учёный секретарьДиссертационного совета 212.232.10,доктор биологических наук, профессорН.П. Алексеев3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность исследования. Фундаментальным регуляторныммеханизмом в живой клетке является редокс-регуляция передачи сигналов иэкспрессии генов (Filomeni et al., 2002; Biswas et al., 2006).

Ведущая роль вредокс-регуляции и поддержании редокс-статуса клетки принадлежит системеглутатион/ окисленный глутатион (GSH/GSSG). GSH (γ-L-глутамил-Lцистеинил-L-глицин) является одним из ключевых внутриклеточныхантиоксидантов (Biswas et al., 2006). Содержание GSSG в цитозоле повышаетсяв условиях окислительного стресса, что послужило основанием рассматриватьего как агрессивную молекулу.

Однако было показано, что GSSG можетоказывать рецептор-опосредованное действие на внутриклеточные процессы(Filomeni et al., 2002; Townsend et al., 2008).В настоящее время на основе GSSG синтезирован ряд фармакологическихпрепаратов, которые характеризуются иммуномодулирующим и системнымцитопротекторным эффектами (Borisov et al., 2001; Жуков и др., 2004). К этойгруппе препаратов относятся глутоксим® (динатриевая соль GSSG с d-металломв наноконцентрации, «ФАРМА-ВАМ», Санкт-Петербург) и моликсан®(комплекс глутоксима с нуклеозидом инозином, «ФАРМА-ВАМ»).

Несмотря наширокое использование этих лекарственных препаратов в медицинскойпрактике, клеточные и молекулярные механизмы их действия остаются вомногом не изученными.Одной из основных мишеней действия глутоксима и моликсана являютсятакие иммунокомпетентные клетки, как макрофаги (Еремеев, Гергерт, 2013).Ранее на кафедре биофизики Санкт-Петербургского государственногоуниверситета (СПбГУ) было впервые показано, что GSSG, глутоксим и моликсанвызывают увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, [Ca2+]i, связанное смобилизацией Са2+ из внутриклеточных тапсигаргин-чувствительных Са2+-депои последующим депо-зависимым входом Са2+ в перитонеальные макрофагикрысы (Крутецкая и др., 2007; Курилова и др., 2008, 2011а, б). Установленотакже, что во влиянии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i в макрофагахпринимают участие такие сигнальные молекулы, как тирозинкиназы итирозинфосфатазы (Крутецкая и др., 2007; Курилова и др., 2008),фосфатидилинозитолкиназы (Крутецкая и др., 2008), ключевые ферментыфосфоинозитидного пути передачи сигнала фосфолипаза С и протеинкиназа С(Крутецкая и др., 2009), элементы цитоскелета (Крутецкая и др., 2011; Куриловаи др., 2012а, б; Крутецкая и др., 2013; Kurilova et al., 2013; Миленина и др., 2014),рецепторы, ассоциированные с гетеротримерными G-белками (Krutetskaya et al.,2014) и малые G-белки суперсемейства Ras (Крутецкая и др., 2014).4В ходе иммунного ответа активированные фагоциты продуцируютбольшие количества свободной арахидоновой кислоты (АК), котораявысвобождается из мембранных липидов с участием фосфолипаз А2 (ФЛА2) идалее окисляется в клетке по трём основным ферментативным путям с участиемциклооксигеназ, липоксигеназ и цитохром Р-450-подобных эпоксигеназ(Needleman et al., 1986; Lapetina, 1990; Крутецкая, Лебедев, 1993; Dennis et al.,2011).

Продукты метаболизма АК (эйкозаноиды) - это вторичные посредники,которые участвуют в регуляции воспаления, аллергических реакций и целогоряда других физиологических функций клеток и тканей (Needleman et al., 1986;Lapetina, 1990).Воздействие на макрофаги внеклеточных стимулов также приводит кдинамичным перестройкам актинового цитоскелета. Актиновые филаментыучаствуют в таких функциях макрофагов, как хемотаксис, фагоцитоз ипрезентация антигенов (Rougerie et al., 2013). Ранее на кафедре биофизикиСПбГУ было впервые выявлено, что актиновые филаменты участвуют вформировании Са2+-ответов, индуцируемых глутоксимом и моликсаном вперитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др, 2011; Курилова и др,2012б). Морфологические исследования показали, что глутоксим и моликсанвызывают реорганизацию актинового цитоскелета в макрофагах (Курилова и др,2012б; Kurilova et al., 2013).Ключевым участником процессов полимеризации и ветвлениямикрофиламентов является комплекс белков Arp 2/3 (actin-related proteins; белки,связанные с актином), который, в свою очередь, активируется белками WASP(Wiskott – Aldrich syndrome proteins; белки синдрома Вискотта - Олдрича)(Pollard, Borisy, 2003; Rougerie et al., 2013).Известно также, что каскад метаболизма АК и такие элементы актиновогоцитоскелета, как актин-связывающие белки, играют важную роль в сигнальныхпроцессах с участием ионов Са2+ в различных типах клеток (Peppelenbosch et al.,1992; Joseph et al., 2014).

Однако оставалось неизвестным, задействованы ли этивнутриклеточные системы в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i.Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлосьизучение роли каскада метаболизма арахидоновой кислоты и элементовактинового цитоскелета (актин-связывающих белков) во влиянии препаратовиммуномодуляторов глутоксим и моликсан на [Ca2+]i в перитонеальныхмакрофагах крысы.Для достижения этой цели были поставлены и решены следующиезадачи:51) изучить участие ключевого фермента каскада метаболизма АКфосфолипазы А2 во влиянии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в перитонеальныхмакрофагах крысы;2) изучить участие циклооксигеназного, липоксигеназного иэпоксигеназного путей окисления АК в регуляции Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом и моликсаном в макрофагах;3) исследовать участие актин-связывающих белков WASP и Arp 2/3комплекса в действии препаратов глутоксим и моликсан на [Ca2+]i в макрофагах.Научная новизна работы.

С использованием широкого спектра агентов,ингибирующих фосфолипазы А2, циклооксигеназы, липоксигеназы иэпоксигеназы, впервые выявлено участие основных путей метаболизма АК вовлиянии иммуномодуляторов глутоксима и моликсана на [Са2+]i вперитонеальных макрофагах крысы. Впервые показано участие актинсвязывающих белков WASP и белков Arp 2/3-комплекса в регуляции Са2+ответов, вызываемых глутоксимом и моликсаном в макрофагах.Впервые предложены возможные механизмы участия каскадаметаболизма АК и актиновых филаментов в сигнальном каскаде, запускаемомглутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы.Теоретическая и практическая значимость работы. Полученныерезультаты вносят вклад в один из фундаментальных разделов клеточнойбиологии и биофизики - изучение процессов внутриклеточной сигнализации.Результаты исследования станут дополнением к общей модели действиядисульфид-содержащих иммуномодуляторов, которая откроет широкиеперспективы для разработки новых эффективных лекарственных препаратов, атакже для усовершенствования существующих.

Выявление клеточныхмеханизмов влияния препаратов глутоксим и моликсан позволит повыситьэффективность использования этих препаратов в терапии бактериальных ивирусных инфекций, онкологических заболеваний и т.д. Материалы диссертациииспользуются при чтении лекционных курсов «Биофизика», «Механизмывнутриклеточной сигнализации», «Биофизика клеточных процессов», «Основымедицинской биофизики» и «Люминесцентный анализ клеток» для студентовкафедры биофизики и биологического факультета СПбГУ.Основные положения, выносимые на защиту:1. Структурно различные ингибиторы фосфолипазы А2 (4бромфенацилбромид, дексаметазон, преднизолон) вызывают существенноеподавление Са2+-ответов, индуцируемых глутоксимом и моликсаном вперитонеальных макрофагах крысы, что свидетельствует об участиифосфолипазы А2 и каскада метаболизма АК в процессах Са2+-сигнализации,запускаемых глутоксимом и моликсаном в макрофагах.62.

Ингибиторы циклооксигеназ (индометацин, аспирин), липоксигеназ(нордигидрогуаретиковая кислота, каффеиковая кислота, зилеутон, байкалейн) иэпоксигеназ (эконазол, проадифен) подавляют увеличение [Са2+]i, вызываемоеглутоксимом и моликсаном в макрофагах. Полученные результатысвидетельствуют об участии ферментов и/или продуктов метаболизма АК врегуляцииСа2+-ответов,вызываемыхдисульфид-содержащимииммуномодуляторами в макрофагах.3. Ингибиторы белков WASP (вискостатин) и Arp 2/3-комплекса(соединение СК-0944666) существенно подавляют увеличение [Са2+]i,вызываемое глутоксимом и моликсаном в макрофагах, что свидетельствует обучастии актин-связывающих белков в действии глутоксима и моликсана на[Са2+]i в макрофагах.Апробация работы.