Диссертация (Разработка подходов к стандартизации инновационного лекарственного средства в рамках реализации программы стратегии фарма 2020), страница 9

Дальнейшееразвитие методики привело к ее техническому упрощению, а именно выбору вкачестве элюента более простой подвижной фазы состава буферныйраствор/ацетонитрил – 94/6, что не привело к ухудшению хроматографическиххарактеристик.Изменение pH среды в щелочную сторону (использование фосфатногобуферного раствора с pH 6,8) приводило к увеличению абсолютного времениудерживания обоих компонентов и, как следствие, общего времени анализа, чтобыло признано нецелесообразным. Взаимная замена фосфатных буферныхрастворов с pH 2,5 и 3,1 не приводила к существенным изменениям результатованализа, в конечный вариант методики был включен раствор с pH 2,5 как болеетрадиционный для Российской фармакопеи.В качестве неподвижной фазы была предложена колонка с основнымипараметрами С18, 250 мм х 4,6 мм, 5 мкм, сочетающая оптимальные свойства сширокойдоступностьюираспространенностью.Использованиеальтернативной, более короткой колонки (С18, 150 мм х 4,6 мм, 5 мкм)приводило к уменьшению времени удерживания и коэффициента разделенияпиков основного вещества и основной примеси.59Рисунок 8.

Хроматограмма стандартного образца ацикловира, снятая всоответствии с методом Европейской Фармакопеи 8.0Рисунок 9. Хроматограмма образца ациклогермания, снятая всоответствии с методом Европейской Фармакопеи 8.060Рисунок 10.Хроматограмма стандартного образца ацикловира,снятая в соответствии с разработанной методикойРисунок 11.Хроматограмма образца ациклогермания, снятая всоответствии с разработанной методикой (образец ИВ-289,присутствуют пики примесей)612.7.2Валидация методики количественного определения фрагментаацикловира в составе ациклогермания методом ВЭЖХ с УФдетектированием2.7.2.1РезюмеБыла проведена валидация разработанной методики количественногоопределения ацикловира в фармацевтической субстанции. Методика былавалидирована по следующим валидационным параметрам: специфичность,линейность,правильность,прецизионность,аналитическийдиапазон.Подтверждена пригодность разработанной методики для количественногоопределения ацикловира в субстанции ациклогермания.

Подтвержденныйаналитический диапазон методики составил 10 мкг/мл – 100 мкг/мл в водномрастворе, что соответствует содержанию вещества 10% – 100% в исследуемомобразце.Полученныйразработаннуюациклогермания.аналитическийметодикудляПолныйтекстдиапазонпозволяетприменятьанализапрепаратовфармакопейногоразработаннойметодикиприведенвПриложении 1 (Нормативная документация для фармацевтической субстанцииациклогермания).2.7.2.2РастворыПриготовление исходного стандартного раствора (100%, 1 мг/мл).Для приготовления исходного стандартного раствора ацикловира 100 мгстандартногообразца(точнаянавеска)помещаливмернуюколбувместимостью 100 мл, доводили до метки водой Milli-Q, тщательноперемешивали. Конечная концентрация раствора составила 1 мг/мл ацикловира.3.

Приготовление растворов стандартов.Конечная концентрация растворов ацикловира составила:100 мкг/мл (10 мл стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл помещалив мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки водой Milli-Q,тщательно перемешивали);6275 мкг/мл (7,5 мл стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл помещалив мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки водой Milli-Q,тщательно перемешивали);50 мкг/мл (5 мл стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл помещали вмерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки водой Milli-Q,тщательно перемешивали);25 мкг/мл (2,5 мл стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл помещалив мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки водой Milli-Q,тщательно перемешивали).10 мкг/мл (1 мл стандартного раствора с концентрацией 100 мг/мл помещалив мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки водой Milli-Q,тщательно перемешивали).2.7.2.3СпецифичностьПроводили анализ стандартного раствора ацикловира с концентрацией 100мкг/мл, растворителя, раствора плацебо раствора образца ациклогермания.

Вкачестве раствора плацебо использовался водный раствор модельной смеси,содержащей лимонную кислоту, аргинин и германия диоксид в соотношении 4 /1 / 1 (по массе).Для приготовления раствора плацебо 100 мг модельной смеси (точнаянавеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до меткиводой Milli-Q, тщательно перемешивали.Для приготовления исходного стандартного раствора ацикловира 100 мгстандартногообразца(точнаянавеска)помещаливмернуюколбувместимостью 100 мл, доводили до метки водой Milli-Q, тщательноперемешивали. Конечная концентрация раствора составила 1 мг/мл ацикловира.На хроматограмме растворителя и раствора плацебо отсутствовали пики свременем удерживания ацикловира.

Время удерживания пиков ацикловира нахроматограммах стандартного раствора и раствора образца ациклогермания,имеющих различное значение pH, совпадало.63Рисунок 12.2.7.2.4Хроматограмма раствора плацебо.Аналитическая область и линейностьАналитическая область методики составила 10 мкг/мл – 100 мкг/мл в водномрастворе. Содержание ацикловира в субстанции ациклогермания должно быть впределах от 16,0% до 19,0%, следовательно, данная аналитическая областьсоответствует критерию приемлемости (включает в себя интервал от 80% до120% номинального содержания вещества в исследуемом образце.Проводили анализ 5 стандартных растворов ацикловира с концентрациями,находящимисявдиапазонеожидаемыхконцентрацийацикловиравлекарственной форме: 10 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл, 75 мкг/мл, 100 мкг/мл.Данные были обработаны в соответствии с методом наименьших квадратов.

Пополученным значениям были построены калибровочные графики приведенныена рисунках, совместно с уравнениями калибровочных кривых и значениямикоэффициентов корреляции:64Рисунок 13.Калибровочный график №1 зависимости площадипика ацикловира от концентрации в раствореРисунок 14.Калибровочный график №2 зависимости площадипика ацикловира от концентрации в растворе65Полученные коэффициент корреляции соответствует нормам (не менее0,99).Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены втаблицах 4 и 5.Таблица 11. Отклоненияконцентрацийкалибровочныхрастворовотфактических значений, калибровочный график №1.Концентрация,фактическая, мкг/млКонцентрация,рассчитанная, мкг/млε, %Норма, неболее %109,9-1,322524,7-1,325050,71,427574,9-0,1210099,8-0,22Таблица 12. Отклоненияконцентрацийкалибровочныхрастворовфактических значений, калибровочный график №2.Концентрация,фактическая, мкг/млКонцентрация,рассчитанная, мкг/млε, %Норма, неболее %109,9-1,322524,7-1,325050,61,127574,5-0,7210099,7-0,32Хроматограммы стандартных растворов ацикловира приведены нарисунках:от66Рисунок 15.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 10 мкг/мл.67Рисунок 16.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 25 мкг/мл.68Рисунок 17.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 50 мкг/мл69Рисунок 18.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 75 мкг/мл70Рисунок 19.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 100 мкг/мл.2.7.2.5РобастностьБыло проведено исследование стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 100 мкг/мл с использованием двух схожих хроматографическихколонок, Agilent Eclipse XDB-C18 5x4.6x250 и Kromasil 100-5-C18 5x4.6x250.

Врезультате исследования не было выявлено значительной разницы во времениудерживания и площади пика ацикловира (см. Рис. 20, 21).71Таблица 13. Оценка влияния замены хроматографической колонки наметодикуХроматографическаяколонкаВремя удерживанияПлощадьпика4,672258,954,6752228,914,6792274,354,7862244,484,7952270,44,7892246,92Agilent Eclipse XDBC18Kromasil 100-5-C18RSD, %0,76Было проведено исследование стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 100 мкг/мл с использованием компонента А подвижной фазы сконтролируемым значением pH 2.4,а также с контролируемым значением pH2.6. В результате исследования было выявлено незначительное влияниеизменения pH в данном диапазоне на время удерживания ацикловира.Таблица 14.

ОценкавлиянияразбросазначенийpHкомпонентаАподвижной фазы на методикуpH компонента Аподвижной фазыВремя удерживанияПлощадьпика4,6772229,034,6792289,724,6692199,664,5862180,414,5552237,034,5192268,472.42.6RSD, %1,83Было проведено исследование стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 100 мкг/мл при температуре колонки 23 и 27.

В результатеисследования не было выявлено существенного влияния изменения темпратурыколонки в данном диапазоне на хроматографический результат исследования.Таблица 15. Оценкавлиянияразбросаподвижной фазы на методикузначенийpHкомпонентаА72Температурахроматографическойколонки2327Рисунок 20.Время удерживанияПлощадьпика4,6812267,174,6742256,734,6642256,304,6862253,214,6552162,184,6192194,25RSD, %1,92Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 100 мкг/мл (колонка Agilent Eclipse XDB-C18).73Рисунок 21.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 100 мкг/мл (колонка Kromasil 100-5-C18).2.7.2.6Правильность и прецизионностьПроводили анализ 3 образцов стандартных растворов ацикловира сконцентрациями 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл.

Анализ проводили дляодной последовательности из 5 вколов для каждого уровня концентраций.Прецизионность оценивали как повторяемость (сходимость). Для полученныхзначенийконцентрацийбылирассчитанывеличиныотносительногостандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε, %),приведенные в Таблице 16.74Таблица 16.Правильность и прецизионность методики (внутрицикла)введено(мкг/мл)найдено(мкг/мл) посл.1найдено (мкг/мл),среднее значение(n=5)S.D.(n=5)RSD, %(n=5)ε, %9,930,060,61-0,7250,440,220,440,8899,000,420,42-1,009,9510,00109,909,959,8450,2850,565050,4250,1950,7499,4599,0810099,2798,8198,39Для расчета относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %) использовались данные (n=10), полученныев течение одной последовательности (внутри цикла).Полученныевеличиныотносительногостандартногоотклонения(прецизионность) и относительной погрешности (правильность) соответствуютнормам (не более 2%).75Разработка и частичная валидация методики количественного2.7.3определения фрагмента ацикловира в составе ациклогерманияметодом ВЭЖХ с масс-селективным детектированием2.7.3.1РезюмеБыла разработана альтернативная ВЭЖХ-методика количественногоопределенияфрагментаацикловиравсоставеациклогермания,сиспользованием масс-селективного детектера с тройным квадруполем.Методика была валидирована по следующим валидационным параметрам:правильность, прецизионность.