Диссертация (Разработка подходов к стандартизации инновационного лекарственного средства в рамках реализации программы стратегии фарма 2020), страница 8

Исследование проводилось в соответствии с требованиями ГФXIII,длятрехобразцовсубстанции,соответствующихразнымпроизводственным циклам. По результатам испытания было установлено, чтораствор является прозрачным.Было проведено изучение цветности 1% водного раствора субстанцииациклогермания. Исследование проводилось в соответствии с требованиями ГФXIII,длятрехобразцовсубстанции,соответствующихразнымпроизводственным циклам. По результатам испытания было установлено, чтораствор является бесцветным.462.5.4pH раствора.Было проведено изучение значения pH 1% водного раствора субстанцииациклогермания. Исследование проводилось в соответствии с требованиямиГФXIII, для трех образцов субстанции, соответствующих разнымпроизводственным циклам (образцы 1, 2, 3 в соответствии с таблицей 3).Результаты исследования приведены в таблице.Таблица 7.

Изучение pH водного раствора ациклогерманияРезультаты измеренияОбразецЗначение pHWds-1 (1) 6/10/14/22,098Wds-1 (2) 6/10/14/22,103Wds-1 (3) 6/10/14/22,117По результатам исследования было установлено, что значение pH 1%водного раствора ациклогермания достоверно укладывается в диапазон от 2,0до 2,2. Кислая реакция среды субстанции может быть обусловлена наличием вее составе фрагмента лимонной кислоты.

С целью проверки данногопредположение было произведено изучение значения pH 0,6% водногораствора лимонной кислоты (содержание лимонной кислоты в которомколичественно соответствует содержанию фрагмента лимонной кислоты в 1%растворе ациклогермания). Измеренное значение pH составило 2,051.472.6 Изучение спектральных характеристик ациклогерманияСпектрометрия в инфракрасной области при анализе2.6.1ациклогермания2.6.1.1Введение.В качестве основного метода идентификации субстанции ациклогерманиябыл предложен метод спектрометрии в инфракрасной области, описанный в ГФXIII (в таблетках с калия бромидом).

При изготовлении образцов методомпрессования таблеток в качестве матрицы используется чистый калия бромид,несодержащийпостороннихполоспоглощения,предварительноразмельченный и осушенный. ИК-спектр субстанции ациклогермания, снятый вобласти от 4000 до 500 см-1 в диске с калия бромидом, по положению полоспоглощения должен соответствовать эталонному ИК-спектру.2.6.1.2Расшифровка ИК-спектра ациклогерманияБыло произведено исследование ИК-спектров ациклогермания, а такжесубстанций его структурных компонентов (ацикловира, аргинина и лимоннойкислоты), с целью сопоставления полученных спектров и идентификациихарактеристических полос поглощения ациклогермания.

При исследованииобразцов ациклогермания методом спектрометрии в инфракрасной областибыли отмечены следующие характеристические полосы поглощения:• 3443 см-1 (вторичная амидогруппа фрагмента ацикловира)• 2937 см-1 (-СН2- группа фрагмента аргинина)• 1724см-1 (предельнаяалифатическаякарбоксильнаялимонной кислоты).Полученные данные соответствуют теоретическим представлениям охимической структуре ациклогермания (см. Главу 1.5).группаРисунок 2.

ИК-спектр ациклогермания49Рисунок 3. ИК-спектр ацикловира50Рисунок 4. ИК-спектр аргинина51Рисунок 5. ИК-спектр цитрат-ионаАтомно-абсорбционная спектрометрия фрагмента германия в2.6.2составе ациклогерманияДля определения фрагмента германия в составе ациклогермания былпредложенметодатомно-абсорбционнойспектрометрии,сочетающийотносительную простоту анализа и пробоподготовки, а также высокуюселективность.ИспытаниеприведеннымиввоспроизведеныпроводилосьТаблицахна8ибольшинстве9.всоответствииДанныесовременныхспараметрыусловиями,могутатомно-абсорбционныхспектрометров.Таблица 8.

Общие условия испытания.Линия монохроматора, нм265.2Автоподстройка2.0Напряжение ФЭУ, В830.0Раскачка модулятора26.0Длительность оценки нуля, с250.0Время интегрирования, с1.5Коэффициент расчета4.0Таблица 9. Стадии атомно-абсорбционного анализа.СтадииДлительность,сТемпература,°CбытьАргонвнутреннийАргонвнешнийСушка35.0120МалыйВключенПиролиз I25400МалыйВключенОценкануля7.0400ВыключенВключенАтомизация1.52400ВыключенВключенОчистка1.72500БольшойВключенПауза700БольшойВключен53Растворы.В качестве стандарта был использован раствор германия диоксида(Germanium Oxide, ESPI Metals, США) в воде очищенной (класс чистоты MilliQ).Были проведены испытания растворов с различной концентрацией германия(по три испытания для каждой концентрации) и на основании полученныхданных построен первичный калибровочный график (см.

таблицу 10, рисунок6).Таблица 10.Результаты анализа стандартных растворов германия.Концентрация германия встандартном растворе, мкг/млПоглощение резонансногоизлучения (интегр., среднеезначение)10.03950.136100.302501.2431001.6251251.9102502.50054Рисунок 6. Калибровочныйграфик,соответствующийвсемуисследованному диапазону концентраций.Уравнение регрессии (логарифмическая зависимость):f(x)= 0.459ln(x) – 0.386.R2= 0.905.На основании полученных данных был выделен диапазон концентраций, вкотором наблюдалась линейная зависимость, от 1 до 50 мкг/мл, и построенсоответствующий график (см. рисунок 7).55Рисунок 7.

Калибровочныйграфик,соответствующийлинейномудиапазону концентраций.Уравнение регрессии (линейная зависимость):f(x) = 0.024x + 0.027R2= 0.998.Для фармакопейной методики было предложено использовать построениекалибровочного графика по трем точкам, используя диапазон концентрацийстандартного раствора, обладающий наибольшей линейностью (см. рисунок 1),1, 5 и 10 мкг/мл. Исходя из полученных данных, а также информации остроении комплексной молекулы ациклогермания, были предложены методикиприготовления стандартных и испытуемых растворов, а также расчетнаяформула содержания германия.Полный текст разработанной методики приведен в Приложении 1(Нормативнаяациклогермания).документациядляфармацевтическойсубстанции562.7 ВЭЖХ при анализе субстанции ациклогермания2.7.1ВведениеВ качестве основного метода качественного и количественного определенияфрагмента ацикловира в составе субстанции ациклогермания было предложеноиспользование ВЭЖХ с УФ-детектором, так как методики с использованиемданного оборудования общепризнано (в соответствии с ведущими мировымифармакопеями) являются методами выбора для анализа препаратов ацикловира.В результате исследования образца ациклогермания в соответствии с взятой заоснову методикой из Европейской фармакопеи 8.0 была обнаружена еенедостаточная пригодность для переноса в проект НД для ациклогермания безизменений, так как:• времяудерживанияацикловиранахроматограммеобразцаациклогермания и на хроматограмме стандартного раствораацикловира значительно различалось (11 минута у ацикловира, чтосоответствует нормам Европейской фармакопеи, 3 минута уациклогермания)• коэффициент разрешения, рассчитанный для пиков основноговеществаиосновнойпримесинахроматограммеобразцаациклогермания составлял менее 1 (см.

рисунки 8 и 9)Коэффициент разрешения (Rs) рассчитывали по формуле:(Формула 4)Rs =1,18  (t R 2 − t R1 ),Wh1 + Wh 2где:tR2 и tR1 – времена удерживания пиков, мин;Wh1 и Wh2 – ширина пиков на половине высоты.Данный результат предположительно может быть следствием значительнойразницызначенийpHводныхрастворовацикловира,проявляющего57слабощелочные свойства, и ациклогермания, дающего кислотные значения pH.Для подтверждения данного предположения было произведено исследованиеобразца ацикловира, разведенного раствором ортофосфорной кислоты (pH 2,1)в соотношении 1 к 10. Время удерживания пика основного вещества нахроматограмме данного образца соответствовало времени удерживания нахроматограмме ациклогермания.Таким образом, одним из главных критериев разрабатываемой ВЭЖХметодики качественного и количественного определения фрагмента ацикловиравсоставеациклогерманияявлялосьдостижениевысокогопоказателяустойчивости к изменению pH в данном диапазоне.

Другим важным критериемявлялось достижение пригодности разрабатываемой методики без измененияхроматографических условий для оценки примесей (коэффициент разрешениядля пиков основного вещества и основной примеси (Rs) должен быть более 1).Кроме того, важным критерием являлось достижение максимальной простоты ивоспроизводимости методики. Нормы количественного содержания ацикловирав составе ациклогермания были рассчитаны исходя из информации о структурекомплексной молекулы.Методика анализа ацикловира из Европейской фармакопеи являетсяобращенно-фазнойградиентногохроматографическойэлюированияиметодикойподвижнойфазыссиспользованиемпреобладаниемнеорганического компонента, значение pH слабокислое (0-5 минута 100%Компонент А, далее градиент от 100 до 80% Компонента А до 27 минуты, гдеКомпонент А – ацетонитрил/фосфатный буферный раствор с pH 3,1, 99/1,Компонент Б – ацетонитрил/фосфатный буферный раствор с pH 2,5, 50/50).Экспериментальнымпутембылоустановлено,чтоиспользованиеизократического режима элюирования с увеличением доли органическогокомпонента (Компонент А/Компонент Б – 85/15) для всего анализа с первыхминут приводит к невелированию недостатков методики, а именно ксовпадениювремениудерживанияпиковосновноговеществана58хроматограммах ацикловира и ациклогермания и лучшему разделению пиковацикловира и основной примеси на пробах ациклогермания.