Автореферат (Лиганды рецептора NKG2D в комплексной оценке иммунитета у онкологических больных и разработка метода адоптивной иммунотерапии), страница 4

Дляактивации выделенные МНК культивировали на протяжении 7-14 дней в полнойпитательной среде (ППС) RPMI-1640 или Х-vivo 20 (Lonza, США), содержащейчеловеческий рекомбинантный альбумин, с добавлением IL-2 (Биотек, Россия) вконцентрациях 31, 62, 125, 250 или 500 МЕ/мл и IL-15 (ImmunoTools, Германия) в14концентрации 50 нг/мл или без него. Пролиферативную активность, жизнеспособность иоценку кинетики роста клеточной популяции культивируемых клеток оценивали сиспользованием флуоресцентных красителей (PE, CAM) и автоматической сканирующейсистемы микроскопирования в режиме реального времени IncuСyte Zoom (EssenBioScience,CША). Полученные данные обрабатывали с помощью программы IncuCyte Software.Иммуноферментный анализ (ИФА).

Содержание белка sMICA в сыворотке кровибольных перед и на этапах АИТ определяли с помощью ИФА и набора антител HumanELISA Kit (R&D Systems или Abcam, США) по инструкции. Оценку концентраций IL-2, IL-4,IL-6, IL-10, IFN-α, IFN-γ и TNF-α в сыворотке крови или в клеточном продукте производилис использованием набора реагентов (Вектор Бест, РФ) по инструкции. Оптическую плотность образцов измеряли при длине волны 450 нм на фотометре ChroMate4300 (AwarenessTechnology, США).Определение цитотоксической активности лимфоцитов. Цитотоксическую активность лимфоцитов проводили с помощью набора реагентов «Live/Dead» (Molecular Probes,США) и окраски клеток флуоресцентными красителями этидием гомодимером-1 и кальцеином-АМ.

После инкубации клеток-мишеней линии К562, которые смешивали с эффекторами в различных соотношениях, оценивали процент мертвых клеток с использованием автоматического анализатора IncuCyte Zoom (EssenBioScience, CША) или цитофлуориметра.Получение, очистка и определение физико-химических свойств рекомбинантного белка MICA. Получение рекомбинантного белка MICA проводили в рамках сотрудничествас ЗАО «Протеинсинтез». Для этого осуществляли культивирование клеток-продуцентов линииCHO/hsMICA-3D в среде CD OPTICHO при 7,5% СО2, 370С и 100% влажности. Контроль концентрации клеток и их жизнеспособность проводили ежедневно, совмещая с процедурой сменысреды. Очистку белка проводили в несколько циклов, единовременное нанесение на колонкусоставляло 3-3,5 л культуральной среды.

Концентрацию rhsMICA определили с помощью спектрофотометра NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, США). Очистку белка rhsMICA из банкированной культуральной среды проводили с помощью иммуноаффинной хроматографии. Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы генно-инженерных продуктов применялиметод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Дляиммуноблот анализа мембрану после переноса на нее белков инкубировали с моноклональнымиантителами мыши, после чего отмывали и инкубировали со вторичными антимышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Далее мембрану промывали и проявляли сиспользованием субстрата ECL plus, GE Healthcare (Великобритания). Детектировали люминесценцию мембраны с использованием системы ChemiDoc XRS, Bio-Rad (США).15Методика сопроводительной адоптивной иммунотерапии. Проведение АИТ начинали после основного лечения.

Активированные in vitro лимфоциты вводили внутрикожно на 3,5, 7, 9, 11 и 14 день культивирования в количестве 30-100 млн клеток. Далее лечение продолжали бесклеточным продуктом на протяжении 1-3 месяцев 1-2 раза в неделю в зависимости от общего количества клеток, пролиферативной активности и степени активации лимфоцитов. КурсыАИТ повторяли каждые 2-3 месяца в зависимости от особенностей течения заболевания, результатов общелабораторных исследований и показателей иммунитета пациента. До начала и послепроведения АИТ осуществляли мониторинг субпопуляционного состава лимфоцитов, экспрессии маркеров активации, оценивали уровень цитокинов (IL-2, IL-10, IFN-α, IFN-γ и TNF-α) и молекул MICA. Динамическую оценку клеточного состава и маркеров активации лимфоцитов повторяли после очередного курса АИТ через 1, 2-3, 4-6 и 8-12 месяцев.Статистический анализ данных.

Статистическую обработку данных проводили спомощью программ Microsoft Excel 2003, Statsoft Statistica 6.0 (StatSoft, USA) и SPSS® Statistics Subscription (IBM, USA). Для сравнения показателей использовали t-критерий Стьюдентаи непараметрический метод Манна-Уитни с использованием программного обеспеченияSigmaPlot 11.0 (SystatSoftwareInc., США). Различия считали значимыми при р < 0,05.16РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙI – Результаты оценки дисбаланса показателей иммунитета у онкологическихбольныхНа первом этапе оценивали уровень сывороточного MICA (sMICA) у нелеченых онкологических больных различных по иммуногенности нозологических групп, дисбаланс лимфоцитовпериферической крови и уровень цитокинов.Было показано, что в контрольной группе стресс-индуцированные молекулы MICAобнаруживались в минимальных количествах (37±9,5 пг/мл).

Средний уровень sMICA у онкологических больных с различными солидными опухолями достоверно отличался от группыконтроля и превышал его в 3-4 раза (р<0,002) (рис. 2).онкологические больные (n=200)316*контроль (n=60)100050 100 150 200 250 300 350содержание sMICA (%)Рисунок 2 - Уровень стресс-индуцированных растворимых молекул MICA в сывороткекрови здоровых доноров и онкологических больных;*достоверное отличие значения по сравнению с контрольной группой (р<0,05)Данные по содержанию sMICA и распределению больных солидными опухолями отражены в таблице 4.

Достоверные отличия количества sMICA от контрольной группы были выявлены в следующих нозологических подгруппах: рак тела или шейки матки, рак предстательной железы, меланома, рак языка или гортани, рак молочной железы, КРР, рак желудка(р<0,005) (таблица 4). В данных группах наблюдался значительный разброс концентрацийsMICA, максимальные значения (более 1000 пг/мл) были зарегистрированы в группе больных меланомой и КРР. Эти нозологии были выбраны для дальнейшего сравнительного анализа показателей иммунитета, а именно для выявления особенностей субпопуляционногосостава и уровня цитокинов в сыворотке крови.17Таблица 4Концентрация молекул MICA в сыворотке крови здоровых добровольцев ионкологических больных солидными опухолями№ГруппыКоличествопациентовСреднее ± SD(пг/мл)Достоверность60191061216431111531920036,9±9,530,7±18,344,6±35,665,2±85,691,1±56,6125,4±99,5120,9±54,8168,3±76,7168,5±76,7198,7±49,5210,7±111,1126,5±12,7р=0,078р=0,326р=0,149р=0,002р=0,003р<0,001р=0,002р<0,001р<0,001р<0,001р=0,002Здоровые добровольцыРак щитовидной железыРак мочевого пузыряРак почкиРак тела или шейки маткиРак предстательной железы12345678910МеланомаРак языка или гортаниРак молочной железыКолоректальный ракРак желудкаВсего онкологических больныхВ работе показано, что среди 155 больных с солидными опухолями, у которых средний уровень sMICA достоверно отличается от контрольной группы, чувствительность метода составила 41,3%.

Специфичность метода была достаточно высокой – 96,7%. Прогностичность положительного результата составила – 96,9%. Таким образом, вероятность наличияболезни при положительных результатах исследования при солидных опухолях велика.При анализе показателей уровня sMICA у больных меланомой по течению основногозаболевания в отдаленные сроки после первичной диагностики и оценки уровня sMICA пациенты были разделены на две группы: первая со стабилизацией процесса и вторая группа спрогрессированием заболевания.Было обнаружено, что у больных с прогрессированием заболевания средняя концентрация sMICA при первичном обследовании была в 2,8 раз выше, чем в первой группе(р=0,02) (таблица 5).Таблица 5Содержание sMICA в зависимости от исхода заболевания у больных меланомойИсход заболеванияКонцентрация sMICA (пг/мл)Стабилизация (n=19)78,6±35,4Прогрессия (n=16)217,8±134,8** достоверно отличающиеся значения относительно показателей другой группы (р<0,05)Это указывает на то, что обнаружение растворимых форм молекул MICA в высокихконцентрациях служит фактором плохого прогноза и указывает на неблагоприятное течение18меланомы у данных больных.

Однако, при анализе аналогичных показателей у больных КРРтакой зависимости выявлено не было.Было показано, что у больных КРР клинической стадии I (n=6) и II (n=14) достоверноснижена концентрация sMICA по сравнению с III (n=10) и IV (n=8) стадией заболевания(p=0,005) (таблица 6).Таблица 6Уровень sMICA в зависимости от стадии заболевания у больныхСтадияКонцентрация sMICA, (пг/мл)КРРмеланомаI и II183,5±47,899,9±71,2III и IV404,8±116,1*353,5±300,3** достоверно отличающиеся значения относительно показателей другой группыбольных той же нозологии (р<0,05)Подобные результаты были получены при анализе и сравнении данных у больных меланомой с различной распространенностью опухолевого процесса.

Значимые отличия были выявлены у пациентов со стадией I (n=0) и II (n=8) по сравнению с III (n=31) и IV (n=6) стадией сналичием регионарных и отдаленных метастазов. Полученные результаты подтверждают взаимосвязь концентрации sMICA с опухолевой нагрузкой, т.е. стадией заболевания, и могутуказывать на распространенный процесс.Установленные тенденции подтверждают взаимосвязь между уровнем sMICA, развитием злокачественного новообразования и негативным прогнозом болезни и не исключаютвлияния молекул MICA на противоопухолевый иммунный ответ у онкологических больныхс солидными опухолями.При анализе фенотипа лимфоцитов у больных меланомой и КРР относительное содержание популяций В- и Т-лимфоцитов находилось в пределах референсных значений (таблица 7).Отмечено, что в среднем по каждой группе повышено абсолютное и относительное содержаниеТreg и активированных HLA-DR+ лимфоцитов.У больных КРР отмечается не только увеличение содержания NK-клеток, но и активированных NKG2D+ NK-клеток и CD69+ NK-клеток (р<0,05).

Экспрессия активирующегорецептора NKG2D (CD314) была выявлена на 90% NK-клеток, а рецептора CD69 на 43% NKклеток, что превышает данные показатели у группы больных меланомой (таблица 7). С другой стороны, у больных КРР было обнаружено значимое снижение Т-лимфоцитов и активированных CD38+Т-клеток (р<0,05) по сравнению с группой больных меланомой, которой всвою очередь более свойственно повышение количества лимфоцитов с фенотипомCD3+CD38+, CD38+, CD3+CD95+, CD95+ (таблица 7).19Таблица 7Фенотипическая картина лимфоцитов и маркеров активации уонкологических больныхРеференсныеКоличество клетокзначения(%)Фенотип лимфоцитов(% )меланомаКРРЛимфоциты19-3729,8±13,429,0±10,5В-лимфоциты7-177,1±2,86,5±3,5Т-лимфоциты61-8574,7±9,9*69,4±10,8*Т хелперы35-5544,7±12,442,7±9,0Treg1,6-5,88,2±5,96,5±3,7CTL19-3530,6±11,227,5±8,9NKT-клетки0,5-63,0±2,32,2±1,9NK-клетки8-1915,1±9,2*22,9±10,4*+HLA-DR Т-лимфоциты7-1111,7±7,610,0±4,9Активированные лимфоциты (HLA-DR)8-1819,5±8,218,8±6,2Альфа цепь рецептора IL-2 (CD25)2-910,9±6,98,6±5,1CD314 (NKG2D)31-5442,3±11,953,2±9,8NKG2D+NK-клетки7-1212,6±9,1*20,1±9,1*CD389-1521,1±15,5*10,3±6,6*+CD38 Т-клетки20-5038,3±18,331,3±12,2CD6910-3014,6±10,621,1±10,9CD69+NK-клетки3-105,4±4,0*8,9±5,0*CD95 (Fas/APO-1)23-6052,9±21,146,0±16,4+CD95 Т-клетки12-5043,7±17,136,2±11,1*достоверно отличающиеся значения относительно показателей другой группы больных(р<0,05).Полученные данные свидетельствуют в пользу преобладания и большей активацииNK-клеток у больных КРР и преобладании доли Т-клеток и их активации у больных меланомой.