Автореферат (Разработка инъекционных лекарственных форм цифетрилина), страница 4

В колбувместимостью 25 мл переносят 0,85 мл полученного разведения дисперсии и доводятводой до метки. На хроматографическую пластинку наносят по 5 мкл исследуемогообразца ЛФ (содержание сахарозы 5 мкг) и СОВС-4 (содержание сахарозы5 мкг).Пластинку подсушивают в токе воздуха, помещают в хроматографическую камеру сподвижной фазой, закрывают плотно крышкой и хроматографируют восходящимспособом. После достижения фронтом элюента линии финиша (пробег 12 см)пластинку вынимают из камеры и высушивают до полного удаления запахарастворителей. Для обнаружения сахарозы пластинку опрыскивают 0,5 % раствором1-нафтола и нагревают до появления фиолетовых пятен.Выбор подвижной фазы.

Для выбора подвижной фазы ТСХ-анализа сахарозысравнивалисистемырастворителейацетон/ЛУК/вода(15:3:2)ихлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода (25 : 25 : 15 : 5 : 4), применяемые для анализаданного вспомогательного вещества в липосомальных препаратах (табл. 10).Таблица 10Выбор элюента для ТСХ-анализа сахарозы в составе ЛЛФ-лио цифетрилина№Подвижная фаза12ацетон–ЛУК–вода (15 : 3 : 2)хлороформ–н-бутанол–ацетон–ЛУК–вода (25 : 25 : 15 : 5 : 4)Значение RfЛФСОВС-40,720,72стартстартВремя1 ч 20 мин1 ч 35 минВ качестве элюента для ТСХ-анализа сахарозы в составе ЛЛФ-лио выбранасистема растворителей ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (15:3:2), котораяобеспечивала хорошее разделение пятен сахарозы со значением Rf = 0,72, тогда как всистеме хлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода (25 : 25 : 15 : 5 : 4) пятнаанализируемого вещества для образца ЛФ и стандарта оставались на линии старта .Проведена оценка пригодности выбранных хроматографических систем дляТСХ-анализакомпонентовЛЛФцифетрилинапутемопределенияпределаобнаружения вещества.

Пределы обнаружения компонентов ЛФ цифетрилина иоценка пригодности систем приведены в диссертации.16Разработка и валидация методики спектрофотометрического анализацифетрилина в составе ЛЛФ и ЛЛФ-лиоНа первоначальном этапе работы изучали спектральные характеристики ЛВ ивспомогательных веществ.

В электронном спектре поглощения спиртового растворасубстанции цифетрилина в анализируемом диапазоне 250–800 нм обнаружено двамаксимума – (282 ± 2) и (290 ± 2) нм (рис.3А).БРисунок 3. Электронные спектры поглощения спиртового раствора: А – субстанциицифетрилина (концентрация 0,08 мкг/мл) и Б – «пустых» липосомАДля количественного анализа липосомального цифетрилина выбран наиболееинтенсивный пик при (282 ± 2) нм. Для того чтобы изучить влияние вспомогательныхвеществ на абсорбционные характеристики цифетрилина в ЛЛФ и ЛЛФ-лиопроводили исследование спектра поглощения «пустых» липосом с добавлениемсахарозы. В результате в диапазоне от 250 до 300 нм обнаружены 2 пика – (268 ± 2) и(279 ± 2) нм, которые соответствуют максимумам поглощения вспомогательныхкомпонентов ЛФ (рис.

3Б). Установлено, что сахароза (рис. 4А) практически непоглощает излучение в указанном диапазоне (оптическая плотность (А) = 0,003),холестерин (рис. 4В) и ПЭГ-ДГФА (рис. 4Г) имеют небольшое поглощение –суммарное значение А = 0,043. В то же время в электронном спектре поглощенияспиртового раствора ЯФХ обнаружены максимумы при (258 ± 2), (268 ± 2) и (279 ± 2)нм со значением А при 279 нм0,328 (рис. 4Б).Таким образом, липидные компоненты могут влиять на значение оптическойплотности анализируемого раствора ЛФ, что следует учитывать при расчетеколичественного содержания цифетрилина в липосомах. Исходя из этого, в качествераствора сравнения для спектрофотометрического анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лиоцифетрилина предложено использование спиртового раствора «пустых» липосом.17АВБГРисунок 4.

Спектры поглощения спиртовых растворов: А. Сахарозы (концентрация 9 мг/мл),Б. ЯФХ (концентрация 4 мг/мл), В. Хол (концентрация 0,4 мг/мл), Г. ПЭГ-ДГФА(концентрация 0,05 мг/мл)1.Методикаспектрофотометрическогоопределенияцифетрилинавлипосомальной дисперсииПриготовление СО цифетрилина. К 4,0 мг субстанции цифетрилина добавляют 20 млспирта 95 %, полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл идоводят спиртом до метки.

Раствор применяют свежеприготовленным.Приготовление раствора сравнения. 4 мл липосомальной дисперсии «пустых»липосом помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят спиртом 95 % дометки. Раствор используют свежеприготовленным.Проведение анализа. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 4 мллипосомальной дисперсии цифетрилина, добавляют небольшое количество спирта95 %, перемешивают и доводят спиртом до метки. Измеряют величину оптическойплотности исследуемого раствора в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм вмаксимуме поглощения (282 ± 2) нм относительно раствора сравнения.

Параллельнопроводят измерение оптической плотности раствора СО цифетрилина относительнорастворасравнения.Поформулерассчитывают(разведенияодинаковы)концентрацию цифетрилина в ЛЛФ (Х, мг/мл):Х= А × а0/ А0 × 4,где: А и А0 – соответственно оптические плотности растворов образца ЛЛФ и СОцифетрилина; а0 – навеска СО цифетрилина, в мг; 4 – 4 мл образца ЛЛФ цифетрилина.18Относительная ошибка определения цифетрилина в ЛЛФ по данной методикесоставляет 0,71%.2.МетодикаспектрофотометрическогоопределенияцифетрилинавлиофилизатеПриготовление СО цифетрилина.

6,0 мг субстанции цифетрилина растворяют в 30 млспирта 95 %, полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл идоводят спиртом до метки. Раствор применяют свежеприготовленным.Приготовление раствора сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 млпомещают 6 мл липосомальной дисперсии «пустых» липосом и доводят спиртом 95 %до метки. Раствор применяют свежеприготовленным.Проведение анализа.

К содержимому флакона ЛЛФ-лио цифетрилина добавляют 5,3мл воды и перемешивают до получения однородной липосомальной дисперсии. Вмерную колбу объёмом 100 мл количественно переносят полученную дисперсию,доводят спиртом 95 % до метки. Измеряют величину оптической плотностиисследуемого раствора в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм в максимумепоглощения (282 ± 2) нм относительно раствора сравнения. Параллельно проводятизмерение оптической плотности раствора СО цифетрилина относительно растворасравнения. Содержание цифетрилина во флаконе (Х, мг) рассчитывают по формуле(разведения образца СО цифетрилина и ЛЛФ-лио одинаковы):Х= А × а0/ А0,где: А и А0 – соответственно оптические плотности растворов образца ЛЛФ-лио и СОцифетрилина; а0 – навеска СО цифетрилина, в мг.По данной методике относительная погрешность определения цифетрилина вЛЛФ-лио составляет не более 1,5 %.Для подтверждения специфичности аналитической методики сравнивалиэлектронные спектры поглощения спиртовых растворов субстанции цифетрилина,вспомогательных веществ и ЛЛФ-лио цифетрилина.

Как видно на рис. 5 в области250–350 нм кривые спиртовых растворов субстанции и ЛЛФ-лио цифетрилина схожипо форме и положению пиков. Однако вспомогательные компоненты исследуемойЛФ поглощают излучение в области аналитического максимума цифетрилина – (282 ±2) нм, что следует учитывать при количественном анализе цифетрилина.Линейность методики подтверждали измерением аналитических сигналов для7 проб с различными концентрациями цифетрилина в модельной смеси компонентовЛФ в пределах диапазона от 70 до 130% от заявленного содержания в препарате(6,0 мг/флакон).

Значение коэффициента корреляции составило более 0,999%, чтосвидетельствуетоналичиилинейной19зависимостимеждуконцентрациейцифетрилина и оптической плотностью в заданном диапазоне концентраций. Дляподобной линейной зависимости уравнение регрессии имеет вид у=0,37х-0,014.Рисунок 5. Оценка специфичности методики спектрофотометрического анализалипосомального цифетрилинаПравильность методики оценивали методом добавок на модельных смесяхкомпонентов ЛФ цифетрилина, вносимого в концентрациях от 70, 80, 90, 100, 110,120 и 130% от заявленного содержания в препарате.

Установлено, что получаемыеэкспериментальные значения близки к истинным, а относительная ошибка среднегорезультата не превышает 0,5 %. Таким образом, методику спектрофотометрическогоанализа липосомального цифетрилина можно считать правильной.При установлении сходимости методики проводили испытание 6 образцовЛЛФ-лио цифетрилина одной серии в условиях одной лаборатории одним и тем жеисполнителем. Коэффициент вариации составил значение 0,98 %, что свидетельствуето незначительной изменчивости вариационного ряда и прецизионности методики вусловиях повторяемости.Дляоценкипромежуточнойпрецизионностиметодикиопределялисодержание цифетрилина в 6 пробах ЛЛФ-лио цифетрилина одной серии в условияходной лаборатории разными аналитиками в разные дни. При анализе результатовобнаружено, что рассчитанное значение критерия Фишера (Fрас=1,05) не превышалоего табличного значения (Fтаб=5,05). При сравнении расчетного и табличногозначения критерия Стьюдента также выполнялось неравенство tрас=1,01<tтаб=2,23, чтосвидетельствует об отсутствии систематической ошибки измерений.

Таким образом,можно сделать вывод о том, что расхождения результатов анализа, полученных двумяисследователями, случайны.Стандартизация и мониторинг стабильности в процессе хранения ЛЛФ-лиоцифетрилинаДля стандартизации ЛЛФ-лио цифетрилина выбраны показатели, по которымследует контролировать качество препарата после получения и в процессе хранения.К данным показателям относятся: описание, регидратируемость (растворимость20лиофилизата), подлинность, количественное определение, однородность дозирования(содержание цифетрилина во флаконе), однородность массы, размер везикул, рН,потеря в массе при высушивании.Для изучения стабильности и установления срока годности 3 серии ЛЛФ-лиоцифетрилина (01216, 020516, 041016) были заложены на хранение в морозильнуюкамеру с температурой -18 ºС, поскольку такая температура установлена дляхранения липидов.