Автореферат (Исследование цефоперазона в биологических объектах методами электрофореза), страница 3

Электролит – буферный раствор Бриттона –Робинсона, рН 1,8 («ПВЭФ–1»)№ п/пМБСДПФ смЭлектрофоретические группы(х ± ∆х̅; n = 3)Антибиотик – МБСАнтибиотик – стандарт1.2.3.МочаПеченьПочка1.2.3.МочаПеченьПочка1.2.3.МочаПеченьПочка1.2.3.МочаПеченьПочкаЦефазолин, модельная смесь (30 мкг/проба)2,43±0,0712,37±0,0712,33±0,071Цефтриаксон, модельная смесь (30 мкг/проба)4,53±0,0724,63±0,0724,83±0,072Цефотаксим, модельная смесь (30 мкг/проба)5,07±0,1225,0±0,1224,9±0,122Цефоперазон, модельная смесь (30 мкг/проба)6,10±0,1236,07±0,1236,07±0,123111222222333В свою очередь, конфигурация ЭФС антибиотиков в составе МБС идентичнаконфигурации ЭФС соответствующих антибиотиков стандартов, в том числе и дляцефоперазона (рисунок 2).3Б281ДПФ см3А281ДПФ смДПФ см83В 12-2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-7-7-7рНрНрНРисунок 2 - ЭФС по ДПФ см цефоперазона – стандарта (1) и цефоперазона в составе МБС (2):мочи (А), печени (Б), почки (В)В качестве примера (таблица 4), показана ЭФС – идентификация по количественнымхарактеристикам Рi исследуемых антибиотиков на примере МБС – почки.Таблица 4 – Идентификация цефалоспориновых антибиотиков в составе модельнойбиологической смеси (почки) по ЭФС (количественные характеристики)12Цефазолин,Р (х ± ∆х̅;)iСтандарт1,65±0,07МБС(почка)1,65±0,08ЭФС по ДПФсмЦефтриаксон,Цефтриаксон,Р (х̅ ± ∆х̅;)Р (х̅ ± ∆х̅;)iСтандарт2,63±0,12iМБС(почка)2,47±0,07Стандарт2,28±0,08МБС(почка)2,21±0,07Цефоперазон,Р (х̅ ± ∆х̅;)iСтандарт3,12±0,07МБС(почка)3,00±0,08Таким образом, соэкстрактивные вещества биологических объектов не оказываютсущественного влияния на электрофоретический скрининг антибиотиков, в том числе ицефоперазона.Разработка методики идентификации и количественногоопределения цефоперазона методом капиллярного электрофореза (КЭ)При ненаправленном химико-токсикологическом анализе наряду со скрининговойпрограммой необходимо использовать подтверждающие независимые методы, обладающиеболее высокими селективными свойствами.На основании проведённых исследований были установлены оптимальные условияэлектрофореза цефоперазона методом КЭ («Капель – 105М»): кварцевый капилляр внутренним диаметром 75 мкм, общей длиной60 см; рабочий электролит (РЭ) - буферный раствор Бриттона - Робинсона,рН 9,0; растворитель пробы (РП) – РЭ разбавленный водой в 10 раз; ввод пробы давлением – 30 мБар × 15 сек.; положительный электрод со стороны введения РЭ; напряжение : +20 кВ; детекция – встроенный УФ – детектор, 230 нм; программное обеспечение – «Эльфоран для Windows», 2012г.При анализе, пробу цефоперазона растворяют в РП (РЭ, разбавленный водой в 10 раз), чемдостигается концентрирование пробы в начальной стадии электрофоретического процессанепосредственно в капилляре с использованием приёма прямого стекинга.Специфичность электрофоретической методики анализа цефоперазона, изученная вприсутствии близких по строению антибиотиков, показывает, что времена миграции (tm)анализируемых компонентов на ЭФГ в составе стандартных образцов, соответствует таковым всоставе смеси антибиотиков (рисунок.

3).13123328ЭОП1mAU10mAU312Цефтриаксон4Цефуроксим16144mAU18Цефоперазон5ЭОП642ЭОП134мин5678111098mAU76544 ЭОП3210120345мин5678910012345мин678910453mAU2Цефоперазон1Цефтриаксон00Цефуроксим202ЭОП100012345мин678910012345мин678910Рисунок 3 - ЭФГ стандартных растворов антибиотиков цефалоспоринового ряда: цефоперазон,10 мкг/мл (1); цефуроксим, 10 мкг/мл (2); цефтриаксон, 10 мкг/мл (3); смеси антибиотиков (4) по10 мкг/мл и ЭФГ растворителя пробы – (5)Результаты статистической обработки tm (таблица 5) цефоперазона, цефуроксима, цефтриаксонастандартов и в составе смеси, показывают, что сходимость методики идентификациисоответствует валидационным требованиям, а специфичность подтверждается разделительнойспособностью смеси антибиотиков (таблица 6), при этом разрешение пика цефуроксима отЭОП, цефоперазона от цефуроксима и цефтриаксона от цефоперазона составляет значительноболее 1,5, что соответствует валидационным требованиям при идентификации компонентов.Таблица 5 - Результаты статистической обработки величин tm цефоперазона, цефуроксима ицефтриаксона (стандартов) и в составе смеси антибиотиковАнтибиотикМетрологическиеСмесьМетрологическиестандарт, 10характеристикистандартовхарактеристикимкг/млантибиотиков, 10мкг/млtm цефоперазона (х; n = 5)SD = 0,04SD = 0,05x = 6,64x = 6,70RSD,% = 0,60RSD,% = 0,69tm цефуроксима (х; n = 5)x = 7,51x = 9,57SD = 0,06x = 7,38RSD,% = 0,83tm цефтриаксона (х; n = 5)SD = 0,04x = 9,40RSD,% = 0,37SD = 0,04RSD,% = 0,52SD = 0,09RSD,% = 0,9814Таблица 6 - Результаты разрешения (RS) пиков антибиотиков на ЭФГ (концентрация 10 мкг/мл)Цефоперазона от ЭОП6,07RS (х; n = 5)Цефуроксима отцефоперазона2,26Цефтриаксона отцефуроксима9,94Предложенные оптимальные условия для идентификации цефоперазона были взяты за основупри разработке методики количественного определения.Установлена линейная зависимость величины фотометрического сигнала (mAU) в диапазонеконцентраций от 0,1 до 20 мкг/мл, и на основе полученных данных рассчитано уравнениекалибровочного графика Y = 0,0664×Х, коэффициент корреляции составил 0,9998.Оценка правильности и прецизионности методики количественного определения цефоперазонаметодом КЭ на трёх уровнях концентрации в течении 1-го и 2-го дней, показала, что величиныотносительного стандартного отклонения и относительной погрешности соответствуют нормамвалидации.

Нижний предел количественного определения (нПКО) составил 0,1 мкг вещества в 1мл пробы.Таблица 7 - Оценка правильности и прецизионности методики определения цефоперазонаIntra – dayIntеr – dayПроба,Определено, RSD, %ɛ,%Проба,Определено, RSD, % ɛ,% (nмкг/млцефоперазона(n = 5) (n = 5)мкг/мл цефоперазона (n = 5)= 5)(х,%; n = 5)(х,%; n = 5)0,1106,0010,7613,370,1104,0012,9016,041,099,801,491,851,0100,201,922,3920,098,591,551,9220,0100,000,470,59Идентификация и количественное определение цефоперазона вбиологических объектах (МБС) методом капиллярного электрофорезаПри разработке методик количественного определения цефоперазона в биологическихобъектах (моча, кровь, печень) с использованием капиллярного электрофореза, учитывая преждевсего, условия клинического лабораторного анализа, хирургической практики и химикотоксикологического анализа при острых отравлениях, а также лабильность антибиотика придлительном процессе пробоподготовки, было предпринято уменьшение навески до 0,1 г ткани и0,1 мл биологической жидкости, при этом исключили процессы упаривания, и ввели приёмдополнительной очистки путём реэкстрагирования в РЭ разбавленный в 10 раз водой.

Этопозволило в процессе электрофореза в кварцевом капилляре осуществить концентрированиепробы за счёт «стекинга». Предварительно были изучены условия экстракции антибиотика изводных растворов. Исследовалось влияние рН среды (от 2,0 до 6,0), природы органическогорастворителя (хлороформ, этилацетат, эфир диэтиловый, смесь хлороформ ÷ изобутанол, 3:1),объёма экстрагента и кратности экстрагирования. Установлено, что наибольший процент15экстракции наблюдается при использовании в качестве экстрагента органической системы(хлороформ - изобутанол 3:1), при рН 2,0, соотношении водной и органической фаз 3:10,кратности экстрагирования равной 3 и составляет 69,80%.По результатам исследования разработана методика определения цефоперазона в моче(проба 0,1 мл), включающая жидкость-жидкостную экстракцию органической системой(хлороформ ÷ изобутанол, 3:1) с последующей реэкстракцией исследуемого компонента врабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз и проведением электрофореза пробы вразработанных ранее условиях.

При оценке линейности методики проводили анализ семи пробинтактной мочи содержащей от 0,1 до 20 мкг цефоперазона в 0,1 мл (y = 0,0571+0,0967×X; r= 0,9999).ЭФГ цефоперазона в составе МБС (мочи), на трёх уровнях концентрации, показывают,что выбранные условия пробоподготовки и электрофореза позволяют осуществлятьидентификацию антибиотика в присутствии эндогенных компонентов мочи. При этом, на ЭФГинтактной мочи (без добавления цефоперазона) не наблюдается пиков со временем миграциицефоперазона (рисунок 4).Цефоперазон0,80,71Цефоперазон(tm=6.81)20,6( tm=6.95)mAUmAU0,50,40,30,200,10012345мин6786Цефоперазон5(tm=6,99)9012345мин67891078910433410mAUmAU732421100012345мин678910012345мин6Рисунок 4 - ЭФГ цефоперазона в составе мочи: 0,1 мкг/0,1 мл (1); 1,0мкг/0,1 мл (2); 20,0 мкг/0,1мл (3); ЭФГ 0,1 мл интактной мочи (4).

«Капель – 105М»Результаты количественного определения цефоперазона в составе МБС на четырёхуровнях концентрации отражают вполне удовлетворительную сходимость и воспроизводимостьрезультатов в пределах рекомендованной аналитической области, при этом, нПКО составил 0,1мкг цефоперазона в 0,1 мл мочи (таблица 8).16МБС,мкг/млмоча1,010,0100,0200,0Таблица 8 - Оценка правильности и прецизионности методики определенияцефоперазона в мочеIntra – dayIntеr – dayВзято на Определено, в RSD, ɛ,% МБС, Взято на Определено, в RSD, % ɛ,%анализ пересчёте на% (n = 3) мкг/мл анализ пересчёте на (n = 3) (n = 3)мочи мл 1 мл МБС (n = 3)моча мочи мл 1 мл МБС(х,%; n = 3)(х,%; n = 3)0,1101,0013,47 16,75 1,00,197,0011,95 14,850,199,302,53 3,15 10,00,194,634,28 5,320,198,330,88 1,09 100,00,199,305,90 7,330,199,602,85 3,54 200,00,197,240,44 0,54При разработке методики идентификации и количественного определения цефоперазонав крови, предварительно было изучено влияние ряда осадителей белковых веществ на степеньэкстракции антибиотика из крови, плазмы и сыворотки.С этой целью использовали: аммония сульфат, ацетонитрил, водный раствор трихлоруксуснойкислоты рН 2,0, а также проведено прямое экстрагирование без добавления осадителей.Полученные результаты показали, что наибольшая степень экстракции отмечается из плазмы,при использовании в качестве осадителя аммония сульфата, и составляет 44,90% (n=2).На основании проведённых исследований разработана методика идентификации иколичественного определения цефоперазона в плазме крови (проба 0,1 мл) на трёх уровняхконцентрации, включающая осаждение белков аммония сульфатом, с последующейдополнительной очисткой и электрофоретическим определением, как при исследовании мочи.При оценке линейности методики проводили анализ семи проб интактной плазмы содержащейот 0,1 до 20 мкг цефоперазона в пробе (y = 0,0351+0,1148×X; r =0,9996).Результаты определения, представленные на рисунке 8 и в таблице 10, показывают, чтовыбранные условия пробоподготовки и элетрофореза позволяют надёжно осуществлятьидентификацию цефоперазона в присутствии эндогенных компонентов плазмы, а результатыколичественного определения антибиотика на трёх уровнях концентрации отражают вполнеудовлетворительную сходимость и воспроизводимость в пределах рекомендуемойаналитической области.