Автореферат (Исследование цефоперазона в биологических объектах методами электрофореза), страница 2

Валидацияметодик.Обоснование возможности идентификации и количественного определенияцефоперазона в биосубстратах операционного поля хирургических пациентов методомкапиллярного электрофореза.Результаты изучения распределения цефоперазона в тканях операционного поля упациентов с хирургическим вмешательством в процессе антибиотикотерапии.Достоверность научных положений и выводовПолученные с помощью разработанных методик первичные данные являютсядостоверными и правильными, что подтверждено результатами статистической обработки ивалидации.

Расчёты, построение графиков и таблиц проводили с помощью программногообеспечения « Эльфоран для Windows», 2012 г. и «Microsoft Office Excel», 2007 г.Связь задач исследования с планом научной работы кафедрыДиссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ ФГБОУВО «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохраненияРоссийской Федерации (номер государственной регистрации 01201153123).Апробация результатов исследованияОсновные результаты исследований доложены и обсуждены на Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинскойнауки», посвящённой 85-летию профессора Е.Н.

Дормидонтова, научно – практическойконференции с международным участием, посвящённой 70-летию победы в ВеликойОтечественной войне 25-летию «Ярославской государственной медицинской академии», 70-ойЮбилейной Всероссийской научно-практической конференции с международным участием«Актуальные вопросы медицинской науки», 71 –ой Всероссийской научно-практическойконференции с международным участием, посвящённой юбилею президента университета,профессора, академика РАН Ю.В.

Новикова, - Ярославль, - 2013 – 2017гг.Апробация была проведена на совместном заседании кафедр фармацевтической итоксикологической химии, управления и экономики фармации, химии фармацевтическогофакультета, биологической химии, общей хирургии, фармакологии, фармакогнозии ифармацевтической технологии ФГБОУ ВО Минздрава России «Ярославский государственныймедицинский университет» 11 мая 2017 года.7Соответствие диссертации паспорту научной специальностиНаучные положения соответствуют формуле специальности 14.04.02 –«Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведённого исследованиясоответствуют пунктам 3 и 4 области исследования специальности.Личный вклад автораЛичное участие автора выразилось в непосредственном исполнении всех этаповисследования: от постановки цели и задач работы, реализации эксперимента, валидацииразработанной методики, интерпретации полученных результатов до их обобщения,систематизации и формулировке общих выводов.

Автором приведён комплекс исследований поразработке методик изолирования, идентификации и количественного определенияцефоперазона в биологических объектах.Внедрение результатов исследованияПо материалам исследования составлен проект информационного письма: «Химикотоксикологический анализ цефоперазона в моче методом капиллярного электрофореза» дляиспользования в практике химико-токсикологических лабораторий бюро судебно-медицинскойэкспертизы РФ. Полученные акты внедрения подтверждают использование методикизолирования, идентификации и количественного определения цефоперазона в биологическихобъектах судебно-химическим отделением ГБУЗ ЯО «Ярославское областное бюро судебномедицинской экспертизы» (4 акта внедрения от 14.09.2016,13.10.2016,10.10.2016,10.11.2016),химико-токсикологической лаборатории ГБУЗ ЯО «Ярославская областная клиническаянаркологическая лаборатория» (4 акта внедрения от 23.09.2016, 10.11.2016, 13.10.2016,05.12.2016); судебно-химическим отделением ГБУЗ ВО «Бюро судмедэкспертизы» г.Владимира (4 акта внедрения от 08.02.2017).Объём и структура работыДиссертационная работа изложена на 183 страницах печатного текста и состоит извведения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов,списка литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 31 рисунком и 33 таблицами. Списоклитературы включает 212 источников, из них 98 на иностранных языках. В приложениевключены акты внедрения и проект информационного письма «Химико-токсикологическийанализ цефоперазона в моче методом капиллярного электрофореза».ПубликацииПо теме работы опубликовано 8 печатных работ, из них 3 в научных журналах,рекомендованных ВАК.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫОбъекты и методы исследованияОбъекты исследования: в эксперименте были использованы стандартные образцыпрепаратов ряда цефалоспориновых антибиотиков: цефоперазон (Орхид Кемикалз энд8Фармасьютикалз Лтд), цефазолин, цефтриаксон (ЗАО Фармацевтическая фирма«Лекко»), цефотаксим (ОАО «Красфарма»), цефуроксим (ООО «АБОЛмед»), в виденатриевых солей.Модельные смеси биоматериалов (моча, кровь, печень), с различной концентрациейантибиотиков, а также клинические образцы различных тканей, взятые с операционного поля упациентов при проведении хирургических вмешательств.В работе использованы следующие химические реагенты: кислота борная (ГФ XII),кислота хлористоводородная концентрированная (ГФ XII), кислота уксусная ледяная (ГФ XII),кислота ортофосфорная концентрированная (ГФ XII), йод кристаллический (чда), аммиакараствор концентрированный (ГФ XII), аммония сульфат (ГФ XII), натрия гидроксид (чда),ацетонитрил для хроматографии (осч), ацетон (осч), хлороформ (чда), спирт изобутиловый (чда),этилацетат (хч).Методы исследования:исследование проводили с использованием следующихприборов и оборудования: Прибор для электрофореза на бумаге «ПВЭФ-1» Система капиллярного электрофореза «Капель – 105М» (ООО «Люмекс-маркетинг»Россия) со встроенным УФ - детектором Весы аналитические «AUW – 120» (SHIMADZU) Лабораторная центрифуга «ЦЛН – 16» Лабораторная центрифуга «MINI SPINplus» (Eppendorf) Иономер «И – 510» (ООО «НПО Аквилон») Микродозатор с переменным объёмом «Biohit»Обработку электрофореграмм осуществляли с помощью компьютерной программы«Эльфоран для Windows», 2012г.Для проведения статистической обработки результатов исследования использовалипрограммное обеспечение «Microsoft Office Excel», 2007 г.Валидация методик проводилась с учётом требований Российских и зарубежных руководств повалидации биоаналитических методик («Руководство по экспертизе лекарственных средств» М.– 2013; рекомендации FDA и EMA).Результаты исследованияРазработка методики электрофореза – скрининга цефоперазона в группецефалоспориновых антибиотиков методомэлектрофореза на бумагеРазработаны оптимальные условия предварительного этапа электрофореза – скринингаряда цефалоспориновых антибиотиков, в том числе и цефоперазона, с использованиемэлектрофореза на бумаге: прибор – «ПВЭФ–1»; электролит – буферный раствор Бриттона –Робинсона, рН 1,81; хроматографическая бумага марки «FN–4»; напряжение 400 В; время9электрофореза – 1 час; детектор – пары йода (чувствительность обнаружения цефоперазона наЭФГ – 1 мкг в пробе).При этом на первом этапе электрофореза – скрининга (таблица 1) установлено, чтонаблюдаемые длины пути фореза в сантиметрах (ДПФсм) исследуемых цефалоспориновыхантибиотиков характеризуются широким диапазоном, что позволяет выделить, с интервалом в 2см, три электрофоретические группы (ЭГ).Таблица 1 - Электрофоретические группы цефалоспориновых антибиотиков (ЦФА) –стандартов.

Электролит – буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 1,8Антибиотик,ДПФ смИнтервал (группа)30 мкг/пробапо ДПФ см(Х ± ΔХ; n = 3)Цефазолин3,53±0,072,0-4,0 (I группа)Цефтриаксон5,43±0,124,0-6,0 (II группа)Цефотаксим6,0±0,12Цефоперазон6,77±0,076,0-8,0 (III группа)На втором этапе электрофореза – скрининга предложена внутригрупповаяидентификация по электрофоретическим спектрам (ЭФС - графическая зависимость величинДПФ см от рН электролита) исследуемых антибиотиков, с использованием электрофореза набумаге, в выше приведённых условиях (электролит – универсальный буферный растворБриттона – Робинсона в диапазоне, рН 1,8 ÷ 8,0). Результаты эксперимента показали (рисунок 1),что профили ЭФС исследуемых соединений, индивидуальны, не совпадают по форме и высоте,и могут быть использованы для идентификации цефалоспориновых антибиотиков после ихгруппового разделения электрофоретическим скринингом.1083-2 0123456рН789 101001 23 4-5300123456рН789 10ДПФ смДПФ см05 6 78 9 10рН105-1025-10-7-5ДПФ смДПФ см14500123-5-10Рисунок 1 – ЭФС по ДПФ см антибиотиков (стандартов):цефазолина (1), цефтриаксона (2), цефотаксима (3), цефоперазона (4)45рН6789 1010Рассчитаны количественные характеристики ЭФС антибиотиков: ДПФ мин, ДПФ макс, а такжевнутренний коэффициент Рi (как частного отношения приведённых выше величин, увеличенноев 10 раз), представлены в таблице 2.Таблица 2 – Количественные характеристики ЭФС по ДПФ см ряда цефалоспориновыхантибиотиков («ПВЭФ–1»)АнтибиотикЭГКоличественные характеристики ЭФС (х̅ ± ∆х̅); n = 5ДПФмаксДПФминРiЦефазолин14,60±0,072,78±0,071,65±0,07(рН 2,3)(рН 6,0)Цефтриаксон5,43±0,122,07±0,072,63±0,122(рН 1,8)(рН 6,0)Цефотаксим6,00±0,122,17±0,072,28±0,08(рН 1,8)(рН 6,0)Цефоперазон36,77±0,072,15±0,073,12±0,07(рН 1,8)(рН 6,0)ДПФминПримечание: Р =× 10ДПФмаксИзучена возможность электрофореза – скрининга методом электрофореза на бумаге рядапредставителей цефалоспориновых антибиотиков, в том числе и цефоперазона, в присутствиивеществ, соэкстрагируемых органической системой (хлороформ - изобутанол, 3:1) из мочи прирН 2,0, а также из водно-щелочных вытяжек тканей печени и почки.На первом этапе электрофореза – скрининга (таблица 3) установлено, что независимо отхарактера биологического объекта, исследуемые соединения в составе модельнойбиологической смеси (МБС), располагаются по ЭГ, соответствующим расположениюантибиотиков стандартов, при этом цефоперазон входит в третью ЭГ.11Таблица 3 - Электрофоретические группы ряда цефалоспориновых антибиотиков в составемодельных биологических смесей (МБС).