Диссертация (Нарушение функции подоцитов и механизмов самозащиты почки - значение в оценке активности и прогноза хронического гломерулонефрита), страница 14

2.74Таблица 2Методы определения молекулярных медиаторов в моче и сыворотке кровибольных ХГНИзученные показателиНефринурия (моча)Метод определения, наборыКоличествореактивов для исследованиябольныхELISA (Uscnc Life Science Inc.74Wuhan, Kit for human nephrin»,China)ПодоцитыМетод проточной цитофлоуметрии,(подоцитурия) (моча)33(мышиные антитела кподокаликсину, Abcam,Великобритания)МСР-1 (моча)ELISA (BioSource International,63Immunoassay Kit, США, Бельгия)ИЛ-1ра (моча)ELISA (BenderMedsystems, Австрия)80VEGF-А (моча)ELISA (BenderMedsystems, Австрия)80Каспаза-9 (моча)ELISA (BenderMedsystems, Австрия)78ELISA (Enzo, США)84ELISA (Enzo, США)84ELISA (Enzo, США)84ИЛ-6 (моча)ELISA (Invitrogen, США)84ИЛ-10 (моча)ELISA (eBiosciеnce, Австрия)84ELISA (R&D Systems Quantikine,77БТШ-70 (моча)АнтителакБТШ70(сыворотка)БТШ-27 (моча)Металлопротеиназы-2и-9 (моча)США)ТИМП-2ELISA (R&D Systems Quantikine,США)77752.2.3 Определение антител к БТШ-70 в сыворотке крови с помощью ELISAУровень антител к БТШ-70 определялся в сыворотке крови больных.Антитела к БТШ-70 исследовали в сыворотке крови у 82 больных ХГНиммуноферментным методом (набор для определения антител к БТШ70 «Enzo»,США).

10 мл крови центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Сыворотку кровизамораживали в пробирках типа Эппендорф 2мл и хранили в рефрижераторе притемпературе -200С.Определение всего спектра медиаторов в моче и сыворотке больных ХГНбыло проведено на базе межклинической иммунологической лабораторииФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (СеченовскийУниверситет).У 85 больных ХГН образцы мочи и крови брали до начала леченияиммуносупрессивными препаратами, у 74 пациентов – на фоне продолженияначатой ранее терапии преднизолоном и/или цитостатиками.

При проведениииммуносупрессивной терапии оценивали наличие/отсутствие ответа и срокидостижения ремиссии заболевания. Ответом на проводимую имуносупрессивнуютерапию считали уменьшение протеинурии менее 0,3г/сут. со стабильнойфункцией почек или уменьшение протеинурии на 50% и более от исходной (снормализациейбелковсывороткикрови–купированиенефротическогосиндрома) при условии улучшения или сохранения стабильной функции почек.Для оценки прогностического значения исследованных тестов у больных ХГНбыло проанализировано течение заболевания и ответ на иммуносупрессивнуютерапию в зависимости от исходной величины нефринурии - у 23 пациентов,подоцитурии - у 32 пациентов, уровня антител к БТШ-70 в сыворотке крови- у 37пациентов.2.2.4 Определение экспрессии факторов «системы самозащиты» с помощьюиммуногистохимического метода в ткани почкиВ ткани почки больных ХГН были изучены (таб.

3):76- количество подоцитов по экспрессии ядерного маркера - опухоли Вильмса (WT1)- белок теплового шока -70- количество Tрег клеток в воспалительном инфильтрате (по экспрессии ядерноготранскрипционного фактора FoxP3) (таб. 3).Иммуногистохимическое исследование биоптатов почек проведено 39больным ХГН. Оценена экспессия экспрессия БТШ-70 и FoxP3 –ядерного факторарегуляторныхТ-лимфоцитов(CD4+CD25+),секретирующихпротивовоспалительный ИЛ-10, а также степень подоцитопении по количествуокрашенных WT-1 ядер подоцитов.Для иммуногистохимического исследования ткани почки использованыследующиенаборы:поликлональныеантителакроликакБТШ70«SpringBioscience», США, в разведении 1:800, поликлональные антитела кроликак FoxP3 «SpringBioscience», США, в разведении 1:200, антитела моноклональныемышиные к протеину опухоли Вильмса 1 (WT1), клон 6F-H2, DACO, готовыеантитела) 30 мин при комнатной температуре.

Для получения окраскииспользовали систему визуализации - EnVision («DAКO», Дания).Результаты иммуногистохимического окрашивания оценивали и выражалиполуколичественно: экспрессия отсутствует(-); очаговая экспрессия слабойинтенсивности (+), множественные очаги экспрессии умеренной интенсивности(++), множественные очаги экспрессии выраженной интенсивности (+++).Спомощьюморфометрическогометодабылооцененочислопротивовоспалительных Т-рег клеток в ткани почки по экспрессии Fox-P3позитивных ядер в воспалительных интерстициальных инфильтратах (в корковомслое на участке 1,5 мм2).77Таблица 3Показатели в ткани почки больных ХГНИзученные медиаторыМетод определения, наборыКоличествореактивов для исследованиябольныхWT-1 (количествоантитела моноклональныеподоцитов в клубочке)мышиные к протеину опухоли40Вильмса 1 (WT1), клон 6F-H2,DAКO, ДанияБТШ-70поликлональные антитела кролика39к БТШ70, SpringBioscience, СШАFoxP3 (количество Т поликлональные антитела кроликарегклеток39в к FoxP3, SpringBioscience, СШАвоспалительныхинфильтратах)Степень подоцитопении оценивали по среднему числу WT-1 -позитивныхядер клубочка на 1 срез, изучали 4-5 последовательных срезов, подсчет ядерпроводили в нескольких клубочках, определяли средние значения показателя вбиоптате почки пациента.

В качестве контроля были использованы образцы тканипочек (n=20), удаленных в связи с урологическими причинами, при исследованиикоторых не было выявлено гломерулярной патологии.2.3 Методы оценки антипротеинурического действия препарата,блокирующего эффекты МCP-1, у больных ХГНВ исследование включено 7 больных хроническим гломерулонефритом (1женщина и 6 мужчин в возрасте 31 [24; 57] года) с активным течением ХГН: сперсистирующей протеинурией более 1г/сут,укоторых возможно былоотсрочить патогенетическое лечение кортикостероидами и цитостатиками на 378месяца без высокой вероятности ухудшения. Каждый пациент подписывалинформированное согласие на участие в исследовании.Морфологически диагноз был подтвержден у 6 больных: у 4 больных былиотмечены морфологические варианты протеинурического гломерулонефрита:мезангиокапиллярныйГН-1,мембранознаянефропатия-1,минимальныеизменения -1, фокальный сегментарный гломерулосклероз-1.

У 2 выявленмезангиопролиферативный ГН.У 4-х больных с выраженным мочевым синдромом уровень суточной ПУ всреднем составлял 2,03 [1,48; 3,92] г/сут, у одного больного ПУ сочеталась свыраженной эритроцитурией (до 100 в п/зр.), у 3-х – с умеренной эритроцитурией(до 20 в п/зр). У 3-х больных отмечалось начальное снижение функции почек(креатинин в среднем 1,27 [1,17; 1,54] мг/дл, СКФ 62-74 мл/мин). У 2 - умереннаяартериальная гипертензия (АД до 160/100 мм рт.ст.).У 3 больных отмечался умеренный нефротический синдром (НС):протеинурия составляла в среднем 2,5 [2,46; 5,28] г/сут, альбумин 29 [27,6; 30]г/л, у двух больных НС сочетался с умеренной эритроцитурией до 20 в п/зр.Функция почек у этих больных была сохранна: креатинин 0,68 [0,64; 0,72] мг/дл,СКФрасч. по CKD-EPI 100-140 мл/мин) У всех больных отмечалась умереннаяартериальная гипертензия (АД до 150/100 мм рт.ст.).Клиническая характеристика обследованных больных дана в таб.

4.В ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ разработан препарат, представляющий собойпептид Х молекулы МСР-1(65-76 МСР-1). Пептид X МСР-1 (65-76) представляетсобой последовательность аминокислот H-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Pro-LysThr-OH. Показано, что блокирующий механизм действия пептида МСР-1 (65-76)обусловлен связыванием гликозаминогликанов на поверхности клеток иконкурентным вытеснением эндогенного МСР-1 и, возможно, других хемокинов,благодаря чему осуществляется противовоспалительное действие и протективноевлияние на подоциты.79Исследование было одобрено МЗРФ разрешением N720 от 16.02.2012г,Советом по этике при Министерстве здравоохранения и социального развитияРоссии N 34 от 08.02.2012г., Межвузовским комитетом по этике, протокол N02-12от 16.02.2012г.Таблица 4Клиническая характеристика больных, леченых препаратом,блокирующим МСР-1Возраст, годыПолПротеинурия, г/сутЭритроцитурияОбщий белоксыворотки крови, г/лАльбумин сывороткикрови, г/лКреатининсыворотки крови,мг/длСистолическоеартериальноедавление,мм рт.

ст.Диастолическоеартериальноедавление,мм рт. ст.Длительностьнефрита, годыМСР-1 в моче, пг/млМС (n=4)НС (n=3)38,5 [27;55]3м/1ж3,07 [2,02; 4,12]У 3 умеренная;У 1 выраженная64,2 [61,3; 67,6]24 [21;57]3м2,91 [1; 5,28]У 2 умеренная;у 1 выраженная48,7 [44,4;56,3]40,8 [38,9; 43,7]29 [27,6; 37,2]0,071,27 [0,94; 1,54]0,72 [0,64; 1,14]0,15140 [125;160]130 [130;150]0,7295 [80;100]80[80;90]0,374 [3;17,5]0,5 [0,5;5]102 [62;582]0,2101,4 [77,2; 195,3]Достоверностьразличий, р0,380,720,030,72Препарат вводили больным ХГН по следующей схеме: в первую неделюлечения - 6 инъекций по 2,5мг с интервалами 6 часов между двумя первыми, 24часа между последующими двумя, 48 часов между пятой и шестой инъекциями.Первые 2 инъекции выполнялись внутривенно, остальные 4 – внутримышечно(суммарная доза – 15мг) (рис. 5). В выборе интервалов и кратности междувведениями препарата в первую неделю лечения ориентировались на схему,использованную у пациентов при стентировании коронарных сосудов с целью80подавления острого воспаления.

У 6-ти больных через четыре недели курслечения повторяли. Всего проведено 3 полных курса введения препарата. Уодного больного в связи с нарастанием тяжести НС проведен однократный курслечения препаратом, на 21 сутки была начата стандартная иммуносупрессивнаятерапия глюкокортикостероидами и циклофосфамидом.60 ч.в/в2,5мгИнграмона24ч24ч48ч48чв/м по 2,5мгв/в – препарат вводился внутривеннов/м – препарат вводился внутримышечноРисунок 5.