Автореферат (Разработка методик совместного количественного определения лекарственных веществ - субстратов-маркеров различных изоферментов цитохрома P450 методом LC-MS-MS)

На правах рукописиЕгоренков Евгений АндреевичРАЗРАБОТКА МЕТОДИК СОВМЕСТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГООПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ – СУБСТРАТОВМАРКЕРОВ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФЕРМЕНТОВ ЦИТОХРОМА P450МЕТОДОМ LC-MS/MS14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата фармацевтических наукМосква – 2019Диссертационная работа выполнена в федеральном государственном автономномобразовательном учреждении высшего образования Первый Московский государственныймедицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)Министерства здравоохранения Российской ФедерацииНаучный руководитель:доктор фармацевтических наук, профессорРаменская Галина ВладиславовнаОфициальные оппоненты:Каленикова Елена Игоревна – доктор фармацевтических наук, профессор,Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшегообразования «Московский государственный университет имени М.В.

Ломоносова»Факультет фундаментальной медицины, кафедра фармацевтической химии, фармакогнозиии организации фармацевтического дела, заведующий кафедройЖердев Владимир Павлович – доктор медицинских наук, профессор, Заслуженныйдеятель науки РФ, Федеральное государственное бюджетное н а у ч н о е учреждение«Научно– исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, заведующийлабораторией фармакокинетикиВедущая организация:Федеральное государственное автономное образовательного учреждение высшегообразования «Российский университет дружбы народов» Министерство науки и высшегообразования Российской Федерации (ФГАОУ ВО РУДН), г. МоскваЗащита диссертации состоится « »2019 г.

вч. на заседанииДиссертационного Совета Д 208.040.09 при ФГАОУ ВО Первый МГМУ имениИ.М. Сеченова (Сеченовский Университет) Минздрава России по адресу: 119019, г.Москва, Никитский бульвар д. 13.С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ФГАОУ ВО Первый МГМУ имениИ.М. Сеченова (Сеченовский Университет) Минздрава России по адресу: 119034,г. Москва, Зубовский бул., д. 37/1 и на сайте организации www.sechenov.ru.Автореферат разослан «»2019 г.Ученый секретарьДиссертационного Совета Д 208.040.09доктор фармацевтических наук, профессор2Демина Наталья БорисовнаОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯОдной из проблем современной медицины является возникновениенежелательных лекарственных явлений при приёме лекарственных средств. Ктаким явлениям относятся как прогнозируемые нежелательные лекарственныереакции (передозировка, побочные эффекты, связанные со свойствами ЛС), так инепрогнозируемые (непереносимость, аллергические и псевдоаллергическиереакции).

Нередко фармакокинетические параметры одного и того же препаратаварьируют у различных пациентов даже одной этнической группы. Зачастуюнаибольший вклад в риск возникновения данных явлений вносит измененнаяактивность ферментов метаболизма. Одной из основных систем ферментов,отвечающих за метаболизм как эндогенных, так и экзогенных веществ, являетсясистема цитохрома P450 (CYP), учавствующая в метаболизме практически всехлекарственных веществ. CYP включает в себя множество изоферментов, каждыйиз которых обладает собственной функцией в процессе метаболизма икатализирует определённые химические реакции превращения различныхфункциональных групп тех или иных ксенобиотиков и эндогенных веществ.

Наданный момент выделено более 1000 изоферментов CYP, объединенных всемейства и подсемейства. Несмотря на большое количество изоферментов, естьопределенные изоферменты CYP, вносящие наибольший вклад в процессыбиотрансформации по сравнению с другими изоферментами. Таковыми являютсяизоферменты CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4 и CYP2D6. На их долю суммарноприходитсяоколо80%известныхлекарственныхвеществ.Помимобиотрансформации ксенобиотиков, данные изоферменты активно участвуют вметаболизме различных эндогенных соединений (глюкокортикоиды, холестерин).Существует несколько подходов к определению активности изоферментов CYP,одним из которых является метод фенотипирования, заключающийся вопределении активности фермента по значению «метаболического отношения» отношения концентрации метаболита к концентрации субстрата в биожидкостяхорганизма.

На данный момент разработано большое количество методик3определения активности индивидуальных изоферментов CYP. В последнее время,в связи с появлением таких высокочувствительных и селективных методов, каквысокоэффективнаяжидкостнаяхроматографиястандемныммасс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС), набирают популярность«коктейльные» методы фенотипирования, позволяющие определить активностьнескольких изоферментов в одной пробе.СТЕПЕНЬ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯВ настоящее время в литературе описано несколько «коктейльных» методовопределения активности различных изоферментов CYP, однако все они имеют ряднедостатков.

Так, многие предложенные методы подразумевают использованиелекарственныхвеществ-маркеров,являющихсясильнодействующимивеществами, либо способными вызвать нежелательные лекарственные реакции(хлорзоксазон у Bing Zhu et al., декстраметорфан у Kyung-Suk Oh et al., варфарину S. Chainuvati). Ни в одном из описанных «коктейльных» методов неиспользуются эндогенные субстраты, в то время как их использование можетуменьшить риск возникновения побочных эффектов, тем самым повысивуниверсальность и безопасность метода. Методики пробоподготовки зачастуювключают в себя параллельную многократную жидкостную экстракцию как изплазмы крови, так и из мочи, что значительно снижает возможностьиспользования таких методов в повседневной лабораторной практике дляопределения активности метаболизма. Более того, некоторые авторы предлагаютиспользование нескольких видов детекторов для количественного определениясубстратов-маркеров и их метаболитов в раздельных пробах, что также затрудняетвведение подобных методов в практику фармакокинетических лабораторий.4ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯЦелью настоящего исследования является разработка и валидация методикколичественного определения субстратов-маркеров основных изоферментов CYPи их метаболитов при совместном присутствии в биожидкостях организма (плазмакрови и моча) методом ВЭЖХ-МС/МС для определения их активности, используяпри этом в качестве субстратов лекарственные вещества с низким рискомвозникновения нежелательных лекарственных реакций, либо, где это возможно,эндогенные субстраты.ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ1.

Провести анализ описанных в литературе методик определенияактивности изоферментов цитохрома P450 методом фенотипирования in vivo, наосновании изученных данных выбрать основные изоферменты для изучения и ихсубстраты-маркерыссоответствующимиметаболитамидляопределенияактивности выбранных изоферментов.2.Разработатьметодикипробоподготовкиобразцовисследуемыхбиожидкостей (плазмы крови и мочи) для совместного изолирования аналитов.3.Оптимизироватьхроматографическиеколичественногоопределенияисследуемыхлозартан/E-3174,кортизол/6-β-гидроксикортизол,условиявеществдлясовместного(кофеин/параксантин,пинолин/6-гидрокси-1,2,3,4,-тетрагидро-β-карболин) в плазме крови и моче.4.Провестивалидациюразработанныхметодикколичественногоопределения исследуемых веществ в плазме крови и моче.5.Оценитьвозможностьиспользованияразработанныхметодикопределения активности основных изоферментов CYP (CYP1A2, CYP3A4,CYP2C9, CYP2D6) в практике фармакокинетических лабораторий.НАУЧНАЯ НОВИЗНАРазработаны условия пробоподготовки биообъектов для дальнейшегосовместного определения активности CYP1A2, CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6 при5совместном присутствии их специфических субстратов и метаболитов.

В качествесубстратов для CYP1A2 и CYP2C9 подобраны широко распространённыелекарственные вещества c низким риском возникновения нежелательныхлекарственных явлений в принимаемых дозировках (кофеин и лозартан,соответственно), в то время как для изоферментов CYP3A4 и CYP2D6 подобраныэндогенные субстраты (кортизол и пинолин, соответственно) с целью сниженияинвазивности метода.Разработаны и валидированы методики количественного определения присовместном присутствии в плазме крови и моче кофеина, параксантина, лозартана,E-3174, кортизола, 6-β-гидроксикортизола, пинолина и 6-гидрокси-1, 2, 3, 4,тетрагидро-β-карболина методом ВЭЖХ-МС/МС с целью фенотипированияосновных ферментов метаболизма.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬРазработаны теоретические подходы к использованию методик совместногоколичественного определения экзогенных и эндогенных веществ с цельюопределенияактивностиосновныхизоферментовCYP,участвующихвметаболизме лекарственных средств (CYP1A2, CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6).Полученныерезультатыиусловияпробоподготовкимогутбытьрекомендованы для решения задач, связанных с определением активностицитохрома Р450 на примере других эндогенных и экзогенных субстратов егоосновных изоферементов в различных комбинациях.Результаты диссертационного исследования представляют практическуюзначимость для специалистов фармакокинетических лабораторий и клиническихфармакологов, осуществляющих подбор оптимальной фармакотерапии прииспользовании препаратов с узким терапевтическим диапазоном действия, а такжепри лечении пациентов с полипрагмазией либо заболеваниями, влияющими наактивность системы метаболизма.6ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ– Разработанные методики проподготовки образцов биожидкости (плазмыкрови и мочи), позволяющие изолировать исследуемые лекарственные вещества иэндогенные соединения (кофеин, параксантин, лозартан, E-3174, кортизол, 6-βгидроксикортизол, пинолин и 6-гидрокси-1, 2, 3, 4,-тетрагидро-β-карболин) присовместном присутствии.– Разработанные аналитические методики совместного количественногоопределения аналитов в плазме крови и моче методом ВЭЖХ-МС/МС.– Результаты валидации разработанных аналитических методик совместногоколичественного определения аналитов в плазме крови и моче методом ВЭЖХМС/МС по основным параметрам: селективность, линейность, эффект матрицы,степень извлечения, точность и прецизионность, предел количественногоопределения, перенос пробы, стабильность.– Результаты определения активности изоферментов CYP1A2, CYP3A4,CYP2C9, CYP2D6 в различных исследованиях с помощью разработанных методикпробоподготовки и количественного определения.МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯМетодология исследования заключалась в изучении литературныхданных по теме исследования, оценке актуальности темы и степени ееразработанности, постановке соответствующих целей и задач исследования поразработкеметодиксовместногоопределениялекарственныхвеществ–субстратов-маркеров различных изоферментов цитохрома P450 методом LCMS/MS, обработке полученных данных, формулировании выводов на основерезультатов и определении практической значимости результатов работы.Валидацияметодикпроводиласьсогласно«Руководствапоэкспертизелекарственных средств.