Автореферат (1141347), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Том 1» под редакцией А.Н. Миронова, 2013 г., а такжеруководств FDA и EMA. Статистическая обработка полученных результатовизмерения проводилась с использованием программ IBM SPSS Statistics 23.0.0.0 иMicrosoft Excel 2016 методом описательной статистики и T-критерия для7независимых выборок с целью выявления различий между средними значениями.ДОСТОВЕРНОСТЬ НАУЧНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ И ВЫВОДОВПервичные данные, полученные в результате проведенного исследования сиспользованиемВЭЖХ-МС/МС,являютсядостоверными.Разработанныеметодики удовлетворяют критериям приемлемости валидационных параметров.Использованное оборудование зарегестрировано в Реестре средств измерений иимеет соответствующие свидетельства о поверке.АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯОсновные положения работы и результаты исследования доложены нанаучном совете НИИ Фармации «Достижения и перспективы молодых ученыхНИИ Фармации» (Москва, 2014), на Конгрессе Европейской академииаллергологии и клинической иммунологии (EAACI) (Барселона, 2015).
Апробациядиссертациисостояласьфармацевтическойи«31»августатоксикологической2016г.химиинаим.заседанииА.П.кафедрыАрзамасцевафармацевтического факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова.ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРААвтору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальныхисследований, анализе и обобщении полученных результатов. Автором личнопроведенаразработка,валидацияметодиксовместногоколичественногоопределения исследуемых аналитов методом ВЭЖХ-МС/МС, статистическаяобработка результатов исследования. Вклад автора является определяющим навсех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально –теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях,докладах и внедрения в практику.ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯРазработанные в результате проведенной работы методики внедрены в8лабораторную практику для определения активности метаболизма в лабораторииклинической фармакологии ФГБУ «ГНЦ Институт Иммунологии» ФМБА Россиии отдела клинической фармакокинетики Центра клинической фармакологии ФГБУНЦЭСМП Минздрава России.СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ НАУКИДиссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планомнаучных исследований ФГАОУ ВО Первый МГМУ им.
И.М. Сеченова МинздраваРоссии (Сеченовский Университет), комплексная тема: «Совершенствованиеобразовательных технологий додипломного и последипломного образованиямедицинского и фармацевтического образования». Номер государственнойрегистрации 01.2.011.68237.СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙСПЕЦИАЛЬНОСТИНаучные положения диссертации соответствуют формуле специальности14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенногоисследования соответствуют области исследования специальности, конкретнопункту 4 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИДиссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит извведения, обзора литературы, экспериментальной части, 5 общих выводов и спискаиспользованных источников.
Диссертация включает 13 таблиц и 14 рисунков.Библиографический список содержит 122 источника, из них 112 на иностранныхязыках.ПУБЛИКАЦИИПо материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 – в изданиях изПеречня ВАК, 2 – в изданиях, включенных в базу Scopus и Web of Science.9СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследования1.Стандарты определяемых веществСтандартные образцы кофеина (Merck, C1778-1VL), параксантина (SantaCruz Biotechnology, sc-212526), лозартана (Merck, 61188-100MG), E-3174 (SigmaAldrich кат. № 981273), кортизола (Merck, H4001-1G), 6-β-гидроксикортизола(Merck, H6904-1MG), пинолина (Merck, 37858-100MG), 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболина (Aurora Fine Chemicals, А06.795.158), карбамазепина(Merck, 94996-100MG).2.Биологическая матрицаБиологическая матрица – бланковая моча и плазма крови человека,освобожденныеотсодержащихсяэндогенныханалитов(кортизол,6-β-гидроксикортизол, пинолин, 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин).Для приготовления бланковой мочи биообъект подвергали двухкратнойжидкостной экстракции смесью этилацетат : гексан : диэтиловый эфир (50:35:15)с последующим добавлением к отделенной водной фазе боратного буфера (pH =9,4) и смеси этилацетат : гексан (50:50).Бланковую плазму крови, очищенную от эндогенных веществ, готовилипутем жидкостной экстракции.
К образцу плазмы крови добавляли 0,1 М растворгидроксида натрия и смесь диэтиловый эфир : этилацетата (3:1). Проводилиэкстракцию, органический слой отбрасывали, оставляя водный слой в качествебланка.Предварительный процесс экстракции позволяет в дальнейшем проводитьколичественное определение эндогенных веществ в любых образцах мочи иплазмы крови без необходимости предварительного определения среднегоэндогенного уровня в популяции.3.РеактивыАцетонитрил,муравьинаякислота,аммонияформиат,этилацетат,диэтиловый эфир, изопропиловый спирт, деионизированная вода, натриятетраборат, борная кислота, натрия гидроксид, триэтиламин, ацетон.104.ОборудованиеЖидкостной хроматограф, оснащенный градиентным насосом, дегазатором,автосамплером, трехквадрупольным масс-селективным детектором; колонка cнеподвижной фазой C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкм; центрифуга c охлаждением;встряхиватель типа вортекс; морозильник низкотемпературный для хранениязамороженнойбиожидкости;весыаналитические;дозаторыпипеточныеодноканальные переменного объема 100-1000 мкл.5.
Обработка результатовВалидация методик была проведена по основным валидационнымпараметрам: cелективность, линейность, эффект матрицы, степень извлечения,точность и прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы,стабильность.Результаты исследования1.Выбор внутреннего стандарта.В качестве внутреннего стандарта был выбран карбамазепин. После изученияописанных в литературе «коктейльных» методов, в качестве внутреннихстандартов были опробованы следующие вещества: метопролол, пропранолол,парацетамол и карбамазепин. Метопролол, пропранолол и парацетомол частоприменяются в клинической практике для коррекции различных патологическихсостояний, что может привести к наличию этих веществ в изначальных образцахбиожидкости. Методики с использованием карбамазепина в качестве внутреннегостандарта удовлетворила всем валидационным критериям.
К тому же, структуракарбамазепина схожа со структурами молекул пинолина и его метаболита, чтопозволило снизить значение нижнего предела количественного определенияданных веществ засчет оптимизации хроматографических параметров подопределение внутреннего стандарта.2.Пробоподготовка.Пробоподготовка мочиПробоподготовка мочи проводилась методом жидкостной экстракции.11К образцу мочи, помещенному в стеклянную пробирку для экстракции,прибавляли стандартный раствор внутреннего стандарта, встряхивали смесь навихреобразной мешалке, затем в пробирку прибавляли экстрагент составомэтилацетат:гексан:диэтиловый эфир (50:35:15), после чего пробирку помещали ввихревую мешалку и экстрагировали. После процедуры экстракции органическийслой отделяли и помещали в чистую пробирку для экстракции.
К оставшейсяводной фазе добавляли боратный буфер (pH=9,4) и смесь этилацетат:гексан (50:50),после чего проводили процедуру экстракции на вихревой мешалке. Органическийслой отделяли и объединяли с органическим слоем, полученным после первогоэтапа экстракции. Объединенный органический слой упаривали в вакуумнороторном испарителе, после чего сухой остаток перерастворяли в метаноле.Пробоподготовка плазмыПробоподготовка плазмы крови проводилась методом твёрдофазнойэкстракции.Картридж с носителем С18 активировали последовательным добавлениемметанола, ацетона, воды и боратного буфера (рH=9,6). К образцу плазмы добавляливнутренний стандарт и концентрированную ортофосфорную кислоту. Полученнуюсмесь осторожно перемешивали, выдерживали и вводили в картридж самотеком.Очистку проводили последовательным добавлением воды деионизированной, 0,1М раствора гидроксида натрия, смеси ацетонитрил – вода (10:90), после чеговысушивали под вакуумом.
Элюировали 0,1% раствором триэтиламина в метанолев стеклянные флаконы и упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в смесиметанол:вода деионизированная (50:50).Разработанныеметодикипробоподготовкибиообразцовпозволяютэкстрагировать исследуемые вещества в одну пробу, что значительно ускоряет иупрощает процесс последующего количественного определения.3.Условия хроматографирования и масс-спектрометрииВ качестве метода определения был выбран метод высокоэффективнойжидкостной хроматографии с обращенной фазой. Детектирование проводилосьметодом тандемной масс-спектрометрии, являющимся наиболее чувствительным и12специфичным из существующих методов, что позволяет совместное определениебольшого количества аналитов за одну аналитическую серию.Хроматографическое разделение проводилось на колонке с неподвижнойфазой C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкм. Для лучшего разделения веществ был разработанметод градиентного элюирования, что позволило разделить аналиты надледащимобразом.
Подвижная фаза: раствор 5 мМ аммония формиата в 0,01% растворемуравьиной кислоты в воде и 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле. Методполучения заряженных частиц – ионизация распылением в электрическом поле(электроспрей, ESI), метод детектирования – MRM-переходы.Значения m/z ионов и времена удерживания аналитов представлены вТаблице 1.Таблица 1 – Параметры масс-спектрометрииАналитКофеинПараксантинЛозартанЕ-3174Кортизол6-β-гидроксикортизолПинолин6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболинКарбамазепинИонпрекурсор(m/z)195,0181,0423,2437,2407,0423,0203,2189,0Дочерний ион(m/z)Приблизительное времяудерживания, мин138,3123,4207,1235,1331,0347,0147,0117,04,13,07,06,24,94,35,01,1237,1194,07,2Количественное определение проводилось методом внутреннего стандарта.После хроматографирования калибровочных образцов, по полученным даннымстроились калибровочные графики зависимости отношения площади пика аналитак площади пика ВС от концентрации аналита.4.ВалидацияВалидациянормативнымиразработанныхдокументамипометодикпроводиласьследующимвпарамерам:соответствиисселективность,линейность, точность и прецизионность, эффект матрицы, степень извлечения,предел количественного определения, перенос пробы, стабильность.13СелективностьДля определения параметров селективности отбирали 6 образцов бланковойбиожидкости (плазма крови или моча), очищенных от эндогенных веществ(очистка проводилась в соответствии с разделом Материалы и методы 2.Биологическаяматрица),ккоторымдобавлялистандартныерастворыопределяемых аналитов.
На хроматограммах образцов интактной биожидкостиотсутствовали пики, характеристические для определяемых веществ, либо ихплощадь не превышала 20% от значения площади пика образца, содержащегоопределяемые вещества на уровне нижнего предела количественного определения(нПКО), что соответствует критериям приемлемости.Хроматограммы, полученные при определении селективности методик,приведены на Рисунках 1 – 4 (моча) и 5 – 8 (плазма крови).Рисунок 1 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества(кофеин/параксантин) на уровне нПКО (10 нг/мл; 10 нг/мл)Рисунок 2 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества (лозартан/E-3174) науровне нПКО (10 нг/мл; 10 нг/мл)14Рисунок 3 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества (кортизол/6-βгидроксикортизол) на уровне нПКО (10 нг/мл; 10 нг/мл)Рисунок 4 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества (пинолин/метаболит)на уровне нПКО (0,5 нг/мл; 0,5 нг/мл)Рисунок 5 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(кофеин/параксантин) на уровне нПКО (50 нг/мл; 50 нг/мл)15Рисунок 6 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(лозартан/E-3174) на уровне нПКО (50 нг/мл; 50 нг/мл)Рисунок 7 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(кортизол/6-β-гидроксикортизол) на уровне нПКО (50 нг/мл; 50 нг/мл)Рисунок 8 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(пинолин/метаболит) на уровне нПКО (0,25 нг/мл; 0,25 нг/мл)ЛинейностьДля определения линейности методик готовили калибровочные образцыв пределах следующих аналитических диапазонов: 10 – 5000 нг/мл длякофеина, параксантина, лозартана, Е-3174, кортизола, 6-β-гидроксикортизола и160,50 – 10,00 нг/мл пинолина и его метаболита в моче; 50 – 10000 нг/мл длякофеина, параксантина, лозартана, Е-3174, кортизола, 6-β-гидроксикортизола и0,25 – 3,00 нг/мл пинолина и его метаболита в плазме крови.По полученным результатам анализа были построены калибровочныеграфики, значения коэффициента корреляции r2 которых составило более 0,99,а отклонения расчётных значений концентраций от теоретических составило неболее 20% для точек на уровне нПКО и не более 15% - для остальных точек,что удовлетворяет критериям приемлемости.Эффект матрицы и степень извлеченияДля определения факторы матрицы и прочих валидационных параметровготовили соответствующие образцы контроля качества: ККА (концентрацияаналитов на уровне нПКО); ККБ (концентрация аналитов на уровнетрёхкратного нПКО); ККВ (концентрация аналитов на уровне 50% от верхнегопредела количественного определения (вПКО)); ККГ (концентрация аналитовна уровне 75% от вПКО).Для оценки влияния сопутствующих веществ, находящихся в матрице, наколичественное определение исследуемых аналитов, проводят расчёт фактораматрицы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
