Автореферат (1141347), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Для определения фактора матрицы используют образцы контроля сконцентрациями аналита на уровне ККБ и ККГ. Анализ проводили в 6 сериях.Коэффициент вариации значений фактора матрицы, нормализованногопо внутреннему стандарту, составил не более 15%, что удовлетворяеткритериям приемлемости.Для расчёта показателей извлечения аналитов из мочи были определеныотношения площадей хроматографических пиков в образцах контроля,полученных путем экстрагирования из образцов контроля качества ККБ и ККГк площадям хроматографических пиков из образцов без проведенияэкстракции. Анализ проводили в 6 сериях.Значения степени извлечения составили не менее 81,51% для кофеина;83,13% для параксантина; 83,77% для лозартана; 87,55% для Е-3174; 82,85%17для кортизола; 84,80% для 6-β-OH-кортизола; 84,86% для пинолина; 84,55%для метаболита пинолина в моче;не менее 85,49% для кофеина; 83,79% для параксантина; 81,25% длялозартана; 78,88% для Е-3174; 79,60% для кортизола; 74,70% для 6-β-OHкортизола; 80,88% для пинолина; 73,60% для метаболита пинолина в плазмекрови.Значение коэффициента вариации степени извлечения составило не более15%, что удовлетворяет критериям приемлемости.Точность и прецизионностьТочность и прецизионность методов внутри и между сериямиопределялась по результатам анализов образцов контроля качества ККА; ККБ;ККВ; ККГ в составе одного аналитического цикла и трёх аналитическихциклов, выполненных одним исследователем.
Анализ проводится в 5 сериях длякаждого значения концентрации.Отклонение среднего значения полученных концентраций для образцовконтроля качества от теоретического значения находилось в пределах 20% дляККА и в пределах 15% для остальных образцов, что соответствует критериямприемлемости точности.Относительноестандартноеотклонениеполученныхзначенийконцентраций для образцов контроля качества составило не более 20% дляККА и не более 15% для остальных образцов, что соответствует критериямприемлемости прецизионности.Нижний предел количественного определенияЗа нПКО методики принималась минимальная концентрация аналита вплазме, для которой возможно количественное определение со значениямисреднего значения концентраций и относительного стандартного отклонения неболее 20 % в диапазоне линейной зависимости.Значения нПКО методик составило 10 нг/мл для кофеина, параксантина,лозартана, Е-3174, кортизола, 6-β-гидроксикортизола и 0,50 нг/мл пинолина иего метаболита в моче; 50 нг/мл для кофеина, параксантина, лозартана, Е-3174,18кортизола, 6-β-гидроксикортизола и 0,25 нг/мл пинолина и его метаболита вплазме крови.Перенос пробыДля определения наличия переноса пробы в хроматографической системепроизводят ввод образца контроля качества ККГ с последующим вводомбланкового образца биожидкости.
Площадь пика с соответствующимивременами удерживания аналитов составляла не более 20% от площади пикана уровне нПКО, что соответствует критериям приемлемости.СтабильностьСтабильностьвплазмекровидобровольцевопределяласьсиспользованием образцов контроля ККБ и ККГ, проведены следующиеисследования стабильности:краткосрочная стабильность аналитов в матрице (24 ч) прикомнатной температуре без пробоподготовкикраткосрочная стабильность аналитов в матрице (24 ч) прикомнатной температуре после пробоподготовкистабильностьвпроцесезамораживания/оттаивания(замораживание в морозильной камере и размораживание при комнатнойтемпературе)краткосрочная стабильность аналитов после пробоподготовки втермостате автосемплерадолгосрочная стабильность (в условиях заморозки в течение 30дней)Анализ проводится в 3х сериях для каждого образца контроля качества.Стабильность аналитов определяется модулем разницы средних значенийконцентраций до и после исследования.
Модуль разниц значений концентрацийсоставил не более 15%, что соответствует критериям приемлемости.195. Результаты фенотипирования изоферментов CYP1A2, CYP2C9,CYP3A4 и CYP2D6 в различных исследованиях с помощью разработанныхметодикРазработанные методики были успешно использованы для фенотипическогоисследования изоферментов CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4 и CYP2D6 в различныхисследованиях.Методика была использована для доказательства изменения активностиметаболизма у больных гормон-зависимой бронхиальной астмой. Для оценкиметаболической активности у больных по дизайну эксперимента было достаточноизучить только активность CYP3A4.
В результате исследования было показано, чтоу больных гормон-зависимой бронхиальной астмой, получающих терапиюсистемными ГКС, обнаружено повышение активности CYP3A4 по сравнению создоровыми добровольцами; отношение уровня эндогенного 6β-гидроксикортизолак кортизолу в плазме крови пациентов с бронхиальной астмой больше на 67%(p=0,007 при α=0,95) от аналогичного значения у здоровых добровольцев.Методика была использована для определения изменения активностисистемы биотрансформации у пациентов после трансплантации печени.
Образцымочи были получены из Отделения трансплантации печени НИИ скорой помощиим. Н.В. Склифосовского. В исследовании приняли участие 2 группы по 11человек: в 1ую группу входили пациенты, перенесшие трансплантацию печени, во2ую – здоровые добровольцы в качестве контроля. Полученные значенияметаболических индексов приведены в Таблице 3.Таблица 3 – Средние значения (±стандартное отклонение) метаболическихиндексовCYP1A2CYP2C9CYP3A4CYP2D6Группа №12,41±0,63 *2,61±1,18 *2,18±1,22 *2,52±1,38 *Контроль1,25±0,620,42±0,231,05±0,360,77±0,53* - статистически значимое различие от значения контрольной группы (p<0,05)20В результате были выявлены статистически значимые различия вметаболической активности изоферментов CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2D6между группами (двухсторонняя значимость для каждого из изоферментовсоставила менее 0,05 при уровне значимости в 95%).Разработанный«коктейльный»методприменялсядляопределенияактивности основных изоферментов CYP методом фенотипирования у больных сриском возникновения лекарственной аллергии с хронической сердечнойнедостаточностью в анамнезе.
В исследовании принимало участие 3 группы по 20человек. Первая группа – пациенты с эпизодом лекарственной аллергии напрепараты различных фармакологических групп. Вторая группа - пациенты слекарственнойаллергиейисключительнонанестероидныепротивовоспалительные средства. Третья группа – контрольная, без эпизодовлекарственной аллергии. Полученные данные приведены в Таблице 4.Таблица 4 – Средние значения (±стандартное отклонение) метаболическихиндексовCYP3A4CYP2D6CYP2C9Группа №15,01±1,201,24±0,51---Группа №216,82±7,53 *1,33±0,562,14±0,64Контроль4,24±2,311,74±0,912,15±0,93* - статистически значимое различие от значения контрольной группы (p<0,05)Из полученных данных был сделан вывод, что с 95% вероятностью имеютсястатистически значимые различия в активности изофермента CYP3A4 между 1-ойгруппой и контрольной группой, а также 1-ой группой и 2-ой группой.
Активностьже других изоферментов статистически не отличается. Таким образом,хроническая сердечная недостаточность как патология может оказывать влияниена метаболическую активность изофермента CYP3A4. Следовательно, моглапроизойти вторичная реакция организма на принимаемые препараты в виделекарственной аллергии на фоне измененной активности изофермента CYP3A4.21ОБЩИЕ ВЫВОДЫ1.
Проведено изучение описанных в литературеметодикопределенияактивности изоферментов CYP методом фенотипирования in vivo, в том числе и«коктейльные» методы. На основании изученных данных выбраны изоферментыCYP, представляющие наибольший интерес как метаболизирущие наибольшееколичество ксенобиотиков по сравнению с остальными – CYP1A2, CYP2C9,CYP3A4 и CYP2D6. Выбраны субстраты-маркеры и их метаболиты дляопределенияактивностиуказанныхизоферментов-кофеин/параксантин(CYP1A2), лозартан/Е-3174 (CYP2C9), кортизол/6-β-гидроксикортизол (CYP3A4)ипинолин/6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин(CYP2D6).Сцельюповышения эффективности и безопасности методик, для изоферментов CYP3A4 иCYP2D6 были выбраны эндогенные субстраты, а для CYP1A2 и CYP2C9, ввидуневозможностииспользованияэндогенныхсубстратов,быливыбранылекарственные средства с низким риском возникновения нежелательныхлекарственных явлений.2.
Разработаны методики пробоподготовки образцов плазмы крови и мочи. Дляпробоподготовки плазмы крови использовался метод твердофазной экстракции,для мочи - метод жидкостной экстракции. Степень извлечения кофеина,параксантина, лозартана, E-3174, кортизола, 6-β-гидроксикортизола, пинолина и 6гидрокси-1,2,3,4,-тетрагидро-β-карболина из биожидкостей составляет 81-91% длямочи 73-88% для плазмы крови, что позволяет использовать разработанныеметодики для последующего совместного количественного определения аналитовв одной пробе.3.Оптимизированыколичественногохроматографическиеопределениякофеина,условияпараксантина,длясовместноголозартана,E-3174,кортизола, 6-β-гидроксикортизола, пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4,-тетрагидро-βкарболина. Разработанные методики количественного определения исследуемыхвеществ методом ВЭЖХ-МС/МС позволяют определить концентрации каждого изаналитов по данным одного анализа.224.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
