Диссертация (Исследования по разработке и стандартизации комплексного урологического растительного средства), страница 9

Экстракт сухой – лабораторный образец, полученный из сбора.Сбор как объект исследования готовили в условиях лаборатории всоответствии с требованиями общей фармакопейной статьи «Сборы», ГФ XI изд.,вып. 1 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.4.10020.15; изучение внешних признаков – ГФ XIизд., вып. 1 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.4.10020.15; изучение анатомодиагностических признаков проводили согласно ГФ ХI изд., вып. 1 и ГФ РФ XIIIизд., ОФС.1.5.3.0003.15 на микроскопе МБИ-3 (при увеличении 7×8; 7×20; 7×40,10×10) [27, 28]. Результаты документировали с помощью фотоаппарата «CanonPowerShot G16» и микрофотонасадки МФН-12.Экстракт сухой как объект исследования готовили в условиях лаборатории всоответствии с требованиями общей фармакопейной статьи «Экстракты», ГФ XIизд., вып.

2 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.4.1.0021.15 [27, 29].582.2 Методы исследованияДля идентификации и количественного определения БАВ изучаемого сбораи экстракта сухого были использованы известные методики с подбором, длянекоторых из них, условий проведения.2.2.1 Определение показателей качества сбора и экстракта сухогоПоказатели качества сбора растительного проводили общепринятымиметодами в соответствии со статьями ГФ, определяли:- внешние и анатомо-диагностические признаки изучаемого сбора ГФ XI изд.,вып. 1 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.4.10020.15, ОФС.1.5.3.0003.15 [27, 28];- экстрактивные вещества, извлекаемые водой – ГФ XI изд., вып. 1 и ГФ РФXIII изд., ОФС.1.5.3.0006.15 [27, 28];- влажность – ГФ XI изд., вып.

1 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.5.3.0007.15 [27, 28];- золу общую – ГФ XI изд., вып. 2 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.2.2.2.0013.15 [27,29];- золу, нерастворимую в хлористоводородной кислоте – ГФ XI изд., вып. 2 иГФ РФ XIII изд., ОФС.1.5.3.0005.15 [27, 29];- измельченность – ГФ XI изд., вып. 1 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.5.3.0004.15[27, 28];- органическую примесь – ГФ XI изд., вып. 1 и ГФ РФ XIII изд.,ОФС.1.5.3.0004.15 [27, 28];- минеральную примесь – ГФ XI изд., вып.

1 и ГФ РФ XIII изд.,ОФС.1.5.3.0004.15 [27, 28];- микробиологическую чистоту – ГФ РФ XII изд., ОФС 42-0067-07 и ГФ РФXIII изд., ОФС.1.2.4.0002.15 [26, 27];- радиоактивность – ОФС 42-0011-03 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.5.3.0001.15 [27,86].59Показатели качества экстракта сухого проводили согласно фармакопейнымстатьям, определяли:- описание – ГФ XI изд., вып.

2 и ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.4.1.0021.15 [27, 29];- потерю в массе при высушивании – ГФ XI изд., вып. 2 и ГФ РФ XIII изд.,ОФС.1.4.1.0021.15 [27, 29];- тяжёлые металлы – ГФ РФ XII изд., вып. 1 и ГФ РФ XIII изд.,ОФС.1.2.2.2.0012.15 [26, 27].2.3 Фитохимические методы изучения сбора и экстракта сухогоДля подтверждения основных групп БАВ в растительном сборе и экстрактесухом были проведены качественные реакции согласно фармакопейным иобщепринятым методикам с водным извлечением из сбора и раствором экстрактасухого [27, 29, 155].Приготовление водного извлечения сбора:Пробу сырья (анализируемый сбор) измельчали до величины частиц,проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм.

Далее отмеряли точнуюнавеску сбора массой 10,0 г, помещали в круглодонную колбу (объемом 200 мл),добавляли 100 мл воды очищенной. Колбу с навеской в водной смеси соединяли собратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане с моментазакипания в течение 30 мин. Для отделения частиц сырья от полученной вытяжкипроводили фильтрование через фильтровальную бумагу. Экстракцию повторялидважды, водные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом до 25 мл.Приготовление раствора экстракта сухого:Точную навеску сухого экстракта массой 0,5 г помещали в колбу (объемом100 мл), прибавляли 20 мл воды очищенной, перемешивали до растворения.С полученными водными извлечениями сбора и раствором экстракта сухогопроводили качественные реакции на присутствие основных групп БАВ:60Флавоноиды:К 1 мл водного извлечения прибавляли 1 мл 95% спирта, 0,1 г порошкамагния и 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты.

Постепеннопоявлялось красное окрашивание [117].Арбутин:3 мл водного извлечения пропускали через колонку, заполненную алюминияоксидом (нейтральный) размером 0,5×2 см. К фильтрату прибавляли 0,1 мл 2%растворанатриякарбонатаи0,1мл2%спиртовойраствордихлорхинонахлоримида. Появлялось синее окрашивание [117].Дубильные вещества:К 2 мл водного извлечения добавляли несколько капель железоаммониевыхквасцов. Наблюдали черно-синее окрашивание (гидролизуемые) [117].Полисахариды:К 10 мл водного извлечения добавляли 30 мл 95% спирта этилового иперемешивали.

Появлялись белые хлопьевидные сгустки, которые при стояниивыпадали в осадок [117].Сахара:К 1 мл водного извлечения добавляли 2 мл реактива Феллинга и нагревалидо кипения. Происходило выпадение кирпично-красного осадка [117].С целью подтверждения основных групп БАВ в сборе была проведенамикрохимическая реакция на инулин:Инулин:При нанесении раствора йода на коровую часть кусочка корня или порошок,не должно быть синего окрашивания (отсутствие крахмала);При нанесении на порошок корней лопуха нескольких капель 20%спиртового раствора тимола и капли кислоты серной концентрированнойнаблюдали оранжево-красное окрашивание [117].612.3.1 Тонкослойная хроматографияАнализ веществ в изучаемом сборе и экстракте сухом проводили методомтонкослойной хроматографии на пластинах «Kieselgel 60 F254», «TLC Silicagel 60F254» (Merck, Германия) размером 20×20 см, 15×20 см.

Хроматографированиевыполняли в закрытых стеклянных камерах в соответствующих системахрастворителей. Величины Rf идентифицированных веществ являются средними изпяти измерений. В ходе применения ТСХ анализа применялись методикиГосударственной, Европейской Фармокопеи и методы, доступные в научнойлитературе [27, 28, 122, 155].Фенольные соединенияКачественное определение фенольных соединений в сбореПробу сырья (анализируемый сбор) измельчали до величины частиц,проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Далее отмеряли точнуюнавеску сбора массой 10,0 г, помещали в колбу (объемом 100 мл), добавляли 40 мл70% этилового спирта. Колбу с навеской в спиртоводной смеси соединяли собратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане с моментазакипания в течении 1 ч.

Охлаждали при комнатной температуре в естественныхусловиях. После охлаждения для отделения частиц сырья от полученной вытяжкипроводили фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 100 мл. Полученный объем вытяжки доводили до меткисоответствующим растворителем – 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор)[118, 180].На линию старта хроматографической пластины «Kieselgel 60 F254» (Merck,Германия) размером 20×20 см наносили точкой 20 мкл испытуемого раствора и по20 мкл растворов стандартных образцов (СО): апигенина, гиперозида, лютеолин-7гликозида, лютеолина, рутина, нарингенина, кверцетина, галловой кислоты,хлорогеновой кислоты, феруловой кислоты. Предварительно камеру длявосходящей тонкослойной хроматографии насыщали смесью растворителейхлороформ-этилацетат-метанол-5% раствор уксусной кислоты в воде (20:20:20:5) –62подвижная фаза, затем размещали пластину «Kieselgel 60 F254» с нанесеннымипробами.

Окончание элюирования фиксировали визуально по финишной линии,когда растворитель прошел 80-90% от линии старта. Далее пластину вынимали изкамеры, высушивали при комнатной температуре в вытяжном шкафу до полногоулетучивания растворителей. Затем пластинку обрабатывали 5% растворомфосфорно-молибденовой кислоты в 95% этаноле, выдерживали в сушильномшкафу при температуре 100-105°С в течение 5 мин. Более подробно условияпредставлены в работах [118, 180].Качественное определение фенольных соединений в экстракте сухомТочную навеску экстракта сухого массой 2,0 г помещали в колбу (объемом100 мл), прибавляли 40 мл 70% этилового спирта. Колбу оставляли навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещали в ультразвуковую банюна 20 мин.

Для отделения нерастворившихся частиц экстракта от полученногораствора проводили фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 100 мл. Полученный объем раствора доводили до меткисоответствующим растворителем – 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор).Далее проводили хроматографирование и детектирование по вышеприведеннойметодике качественного определение фенольных соединений в сборе.Приготовление растворов стандартных образцов для ТСХ анализафенольных соединений: точную навеску стандартного образца массой 0,05 гапигенина, гиперозида, лютеолин-7-гликозида, лютеолина, рутина, нарингенина,кверцетина, галловой кислоты, хлорогеновой кислоты, феруловой кислотырастворяли в мерной колбе (объемом 100 мл) в 50 мл 70% этилового спирта идоводили тем же растворителем до метки – 70% этиловым спиртом, перемешивали.Свободные сахараКачественное определение свободных сахаров в сбореПробу сырья (анализируемый сбор) измельчали до величины частиц,проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм.