Диссертация (1141308), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Далее отмеряли точнуюнавеску сбора массой 1,0 г, помещали в колбу (объемом 200 мл), добавляли 70 мл50% этилового спирта. Колбу с навеской в спиртоводной смеси соединяли с63обратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане с моментазакипания в течении 1 ч. Охлаждали при комнатной температуре в естественныхусловиях. После охлаждения для отделения частиц сырья от полученной вытяжкипроводили фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 50 мл. Полученный объем раствора доводили до меткисоответствующим растворителем – 50% этиловым спиртом (испытуемый раствор).На линию старта хроматографической пластины «TLC Silicagel 60 F254»(Merck, Германия) размером 15×20 см наносили точкой 20 мкл испытуемогораствора и по 20 мкл растворов стандартных образцов: глюкозы, фруктозы,сахарозы, маннозы, арабинозы, галактозы, рамнозы.
Предварительно камеру длявосходящей тонкослойной хроматографии насыщали смесью растворителейпиридин-этилацетат-вода (20:60:40) – подвижная фаза, затем размещали пластину«TLC Silicagel 60 F254» с нанесенными пробами. Окончание элюированияфиксировали визуально по финишной линии, когда растворитель прошел 80-90%от линии старта. Далее пластину вынимали из камеры, высушивали на воздухе иобрабатывали проявляющим реагентом: тимол-серная кислота конц.-спиртэтиловый 95% (0,5:5:95), выдерживали 10 мин в сушильном шкафу при 100-105°С.Более подробно условия представлены в работах [113, 180].Качественное определение свободных сахаров в экстракте сухомДля этого около 0,2 г (точная навеска) экстракта сухого помещали в колбу(объёмом 200 мл), добавляли 20 мл 50% этилового спирта, колбу оставляли навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещали в ультразвуковую банюна 20 мин. Полученный раствор фильтровали в мерную колбу (объемом 50 мл)через бумажный фильтр и объём доводили тем же растворителем до метки – 50%этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Далее проводили хроматографированиеи детектирование по вышеприведенной методике качественного определениесвободных сахаров в сборе.Приготовление растворов стандартных образцов для ТСХ анализасвободных сахаров: около 0,05 г (точная навеска) СО глюкозы, фруктозы, сахарозы,маннозы, арабинозы, галактозы, рамнозы растворяли в мерной колбе (объемом 10064мл) в 5 мл воды очищенной и доводили до метки 50% этиловым спиртом,перемешивали.ФлавоноидыХроматографическое определение флавоноидов проводили, используяводно-спиртовые извлечения сбора и экстракта сухого, полученные повышеописанным методикам при хроматографировании фенольных соединений.Качественное определение флавоноидов в сборе10 мл испытуемого раствора упаривали на водяной бане и остаток растворялив 2 мл смеси этилацетат-метанол (95:5).
На линию старта хроматографическойпластины «Kieselgel 60 F254» (Merck, Германия) размером 20×20 см наносилиточкой 20 мкл испытуемого раствора и по 20 мкл растворов стандартных образцов:апигенина, гиперозида, лютеолин-7-гликозида, лютеолина, рутина, нарингенина,кверцетина. Предварительно камеру для восходящей тонкослойной хроматографиинасыщали смесью растворителей изопропанол-муравьиная кислота-вода (2:5:5) –подвижная фаза, затем размещали пластину «Kieselgel 60 F254» с нанесеннымипробами.
Окончание элюирования фиксировали визуально по финишной линии,когда растворитель прошел 80-90% от линии старта. Далее пластину вынимали изкамеры, высушивали при комнатной температуре в вытяжном шкафу до полногоулетучивания растворителей. Затем обрабатывали 2% раствором алюминияхлорида (III) в 95% этаноле и выдерживали в сушильном шкафу при температуре100-105ºС в течение 5 мин. Более подробно условия представлены в работах [178,180].Качественное определение флавоноидов в экстракте сухомДля этого около 0,2 г (точная навеска) экстракта сухого растворяли в 2 млсмеси этилацетат-метанол (95:5).
Далее проводили хроматографирование идетектирование по вышеприведенной методике качественного определенияфлавоноидов в сборе.Приготовление растворов стандартных образцов для ТСХ анализафлавоноидов: точную навеску СО (массой 0,05 г) апигенина, гиперозида,лютеолин-7-гликозида, лютеолина, рутина, нарингенина, кверцетина растворяли в65мерной колбе (объемом 100 мл) в 50 мл смеси растворителей: этилацетат-метанол(95:5) и полученный раствор доводили до метки тем же растворителем,перемешивали.АрбутинКачественное определение арбутина в сбореПробу сырья (анализируемый сбор) измельчали до величины частиц,проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм.
Далее отмеряли точнуюнавеску сбора массой 2,5 г, помещали в колбу (объемом 50 мл), добавляли 25 млсмеси метанол-вода (1:1) Колбу с навеской в спиртоводной смеси соединяли собратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане с моментазакипания в течении 10 мин. Для отделения частиц сырья от полученной вытяжкипроводили фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 100 мл. Полученный объем вытяжки доводили до метки тем жерастворителем (испытуемый раствор) [102].На линию старта хроматографической пластины «Kieselgel 60 F254» (Merck,Германия) размером 15×20 см наносили 20 мкл испытуемого раствора и 10 мклрастворов СО: арбутина, гидрохинона, галловой кислоты.
Предварительно камерудля восходящей тонкослойной хроматографии насыщали смесью растворителеймуравьиная кислота-вода-этилацетат (6:6:88) – подвижная фаза, затем размещалипластину «Kieselgel 60 F254» с нанесенными пробами. Окончание элюированияфиксировали визуально по финишной линии, когда растворитель прошел 80-90%от линии старта.
Далее пластину вынимали из камеры, помещали в сушильныйшкаф и растворитель удаляли при температуре 100-105°C. Хроматограмму вначалеобрабатывали 1% раствором дихлорхинонахлоримида в метаноле и затем 2%раствором натрия карбоната безводным. Более подробно условия представлены вработах [102].Качественное определение арбутина в экстракте сухомТочную навеску экстракта сухого массой 0,5 г помещали в колбу (объемом50 мл), прибавляли 25 мл смеси метанол-вода (1:1). Колбу оставляли навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещали в ультразвуковую баню66на 20 мин. Для отделения нерастворившихся частиц экстракта от полученногораствора проводили фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 25 мл. Полученный объем раствора доводили до метки тем жерастворителем (испытуемый раствор). Далее проводили хроматографирование идетектирование по вышеприведенной методике качественного определениеарбутина в сборе.Приготовление растворов стандартных образцов для ТСХ анализаарбутина: точную навеску СО массой 25 мг арбутина, гидрохинона, галловойкислоты растворяли в мерной колбе (объемом 100 мл) в 10 мл метанола,перемешивали.2.3.2 Газожидкостная хроматографияДля анализа получали эфирное масло изучаемого сбора по методике ГФ [25,26], метод 1.
Более подробно условия представлены в работе [119].Пробу сырья (анализируемый сбор) измельчали до величины частиц,проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Далее отмеряли точнуюнавеску сбора массой 20,0 г, помещали в широкогорлую плоскодонную колбу(объемом 1 л), добавляли 300 мл воды очищенной. Затем колбу закрывалирезиновой пробкой с обратным холодильником, к пробке снизу прикреплялиприемник Гинзбepгa. Колбу с содержимым нагревали и кипятили в течении 2 ч.Полученное при перегонке эфирное масло количественно перемещали в мернуюколбу (объемом 10 мл) прибавляли 8 мл спирта этилового 96%. Перемешивали дорастворения и полученный объем раствора доводили до метки соответствующимрастворителем – 96% этиловым спиртом [119].Компонентный состав эфирных масел, полученный из сбора, проводилиметодом ГЖХ на хроматографе «Кристаллюкс-4000М» (Мета-хром, Россия) споследующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощьюпрограммы «NetChrom, V2.1» для «Windows».
В качестве неподвижной фазы67использовалась кварцевая капиллярная колонка HP-5MS (30 м × 0,25 мм × 0,25мкм), заполненная 5%-фенил-95%-метилполисилоксаном. В качестве подвижнойфазы использовался азот. Скорость потока 1 мл/мин, температура: испарителя –200°С, детектора – 250°С. Исходная температура термостата на момент началаанализа 100°С. В процессе эксперимента она изменяется со скоростью 5 град/мини достигает 150°С. Детектор пламенно-ионизационный. Время анализа 10 мин.Объём пробы 1 мкл раствора с разделением потока 1:27 [119].1 мкл полученного спиртового раствора эфирного масла и по 5 мкл растворовстандартных образцов хроматографировали при вышеуказанных условиях.В качестве растворов стандартных образцов были использованы следующиерастворы в спирте 96%:- цинеола спиртовой раствор 0,01%;- камфоры спиртовой раствор 0,01%;- терпинеола спиртовой раствор 0,01%;- анетола спиртовой раствор 0,01%;- туйона спиртовой раствор 0,01%;- лимонена спиртовой раствор 0,01%;- борнилацетата спиртовой раствор 0,01%;- L-пинена спиртовой раствор 0,01%;- камфоры спиртовой раствор 0,01%;- гераниола спиртовой раствор 0,01%;- борнилацетата спиртовой раствор 0,01%.2.3.3 Высокоэффективная жидкостная хроматографияВ высокоэффективной жидкостной хроматографии анализ фенольныхсоединений,органическихкислот,сахаровиарбутинапроводилинавысокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Gilson» (Gilson, Франция)с ручным инжектором «Rheodyne», модель 7125 (Rheodyne, США) с последующей68компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром» для«Windows».
Более подробно условия представлены в работах [108, 109, 112, 180].В качестве неподвижной фазы для фенольных соединений и арбутина былаиспользована металлическая колонка «Kromasil С18» размером 4,6 × 250 мм, 5 мкн;для сахаров и органических кислот – металлическая колонка «Altech OA-1000Organic Acids» размером 6,5 × 300 мм [112, 118].В качестве подвижной фазы для фенольных соединений и арбутина: метанол– вода – фосфорная кислота (конц.) (400:600:5); для сахаров и органических кислот:0,005 М раствор серной кислоты [112, 118].Исследование проводили при комнатной температуре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
