Диссертация (Исследования по разработке и стандартизации комплексного урологического растительного средства), страница 12

Далее отвешивалиточные навески сырья массой по 10,0 г, помещали в колбы (объемом 200 мл),добавляли 70 мл 70% этилового спирта. Колбы с навесками в спиртоводной смеси74соединяли с обратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане смомента закипания в течение 1 ч. Охлаждали при комнатной температуре вестественных условиях. После охлаждения для отделения частиц сырья отполученной вытяжки проводили фильтрование через фильтровальную бумагу вмерную колбу вместимостью 100 мл.

Полученный объем вытяжки доводили дометки соответствующим растворителем – 70% этиловым спиртом (раствор А).10 мл раствора А помещали в мерную колбу (объемом 100 мл), доводилисоответствующимрастворителемдометки–70%этиловымспиртом,перемешивали (растворы компонентов) и снимали спектр поглощения в диапазонедлин волн 220-360 нм.Обнаружение фенольных соединений в экстракте сухомТочную навеску экстракта сухого массой 0,5 г помещали в колбу (объемом100 мл), прибавляли 50 мл 70% этилового спирта.

Колбу оставляли навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещали в ультразвуковую банюна 20 мин. Для отделения нерастворившихся частиц экстракта от полученногораствора проводили фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 100 мл. Полученный объем раствора доводили до меткисоответствующим растворителем – 70% этиловым спиртом (раствор А).В мерную колбу (объемом 100 мл) помещали 1,0 мл раствора А, доводилиэтим же растворителем до метки, перемешивали и снимали спектр поглощения вдиапазоне длин волн 190-360 нм.Приготовлениерастворовстандартныхобразцовдляспектрофотометрических методик фенольных соединений: по 0,05 г СО рутина,кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейнойкислоты, хлорогеновой кислоты, гиперозида, апигенина, кемпферола, арбутинапомещали в мерные колбы (объемом 100 мл), растворяли в 50 мл 70% этиловогоспирта и доводили тем же растворителем до метки – 70% этиловым спиртом,перемешивали.75ФлавоноидыСпектрофотометрический анализ флавоноидов проводили, используя водноспиртовые извлечения сбора и экстракта сухого, полученные по вышеописаннымметодикам при спектрофотометрировании фенольных соединений.

Более подробноусловия представлены в работах [115, 180].Полисахариды (инулин)Определениесодержанияполисахаридов(инулина)проводилиспектрофотометрическим методом в пересчете на фруктозу по методике,изложенной в ГФ XIII, ФС.2.5.0025.15 «Лопуха корни» [27].При проведении методик качественного и количественного определенияБАВ были использованы стандарты фирмы Sigma-Aldrich:- лютеолин-7-гликозид – CAS № 5373-11-5- арбутин – CAS № 84380-01-8- рутин – CAS № 207671-50-9- кверцетин – CAS № 6151-25-3- кофейная кислота – CAS № 331-39-5- галловая кислота – CAS № 5995-86-8- хлорогеновая кислота – CAS № 327-97-9- лютеолин – CAS № 491-70-3- кемпферол – CAS № 520-18-3- апигенин – CAS № 520-36-5- гиперозид – CAS № 482-36-0- фруктоза – CAS № 57-48-7762.3.5 Титриметрические методыАрбутинКоличественное определение арбутина в сборе и экстракте сухомКоличественноеопределениеарбутинапроводилиметодомйодометрического титрования по ГФ XI изд., вып.

2, ст. 27 [29].Органические кислотыКоличественное определение органических кислот в сбореОпределение содержания суммы свободных органических кислот проводилититриметрическим методом в пересчёте на яблочную кислоту, описанным в ГФ ХIизд., вып. 2, ст. 38 [29].Количественное определение органических кислот в экстракте сухомТочную навеску экстракта сухого массой 0,6 г помещали в коническую колбу(объемом 200 мл), прибавляли 100 мл воды очищенной. Колбу оставляли навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещали в ультразвуковую банюна 20 мин. Далее проводили количественное определение согласно методике ГФXI, вып.

2 [29].Дубильные веществаКоличественное определение дубильных веществ в сбореОпределениесодержаниядубильныхвеществпроводилиперманганометрическим методом в пересчете на танин по ГФ XI изд., вып. 1 и ГФРФ XIII изд., ОФС.1.5.3.0008.15, метод 1 «Определение содержания дубильныхвеществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительныхпрепаратах» [27, 28]. Более подробно условия представлены в работах [114, 180].Количественное определение дубильных веществ в экстракте сухомТочную навеску экстракта сухого массой 0,6 г помещали в коническую колбу(объемом 100 мл), прибавляли 50 мл воды очищенной. Колбу оставляли навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещали в ультразвуковую банюна 20 мин. Охлаждали при комнатной температуре в естественных условиях.

Дляотделения нерастворившихся частиц экстракта от полученного раствора проводили77фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбу вместимостью 100мл. Полученный объем раствора доводили до метки соответствующимрастворителем. Далее проводили количественное определение согласно методикеГФ XI изд. и ГФ РФ XIII изд.

[27, 28].2.4 Биологические методы исследованияЭкспериментальные исследования были проведены на белых крысах линииWistar обоего пола (масса 180-200 г.) в осенне-зимний период. Содержаниеживотных соответствовало:- Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правиллабораторной практики»;- «Правилам лабораторной практики» (GLP);- Правилам, принятым «Европейской конвенцией о защите позвоночныхживотных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST№123» от 18.03.1986 (Страсбург, 18 марта 1986).Протокол исследования согласован с этической комиссией Института общейи экспериментальной биологии Сибирского отделения РАН (протокол №6 от25.10.2016).Методоммгновеннойдекапитацииосуществлялиэвтаназиюживотных под легким эфирным наркозом.Объектом исследования служил сбор состоящий из:- листьев брусники – 30%;- травы хвоща полевого – 30%;- корней лопуха – 15%;- плодов укропа огородного – 15%;- травы полыни обыкновенной – 10%.Экспериментальную модель уролитиаза воспроизводили путем введениявнутрижелудочно витамина Д2 в дозе 12000 ЕД/кг массы 1 раз в сутки в течение 20дней (контроль) по методу Higgens H.G.

(1965). Одновременно с введением78витамина Д2 животным опытной группы интрагастрально вводили отваризучаемого сбора в объеме 10 мл/кг. Введение испытуемого комплексногорастительного средства проводили один раз в сутки с начала эксперимента и напротяжении 20 дней. Водные извлечения испытуемого средства готовили потребованиям ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.4.1.0018.15 «Настои и отвары» [27].Животнымконтрольнойгруппывводилипоаналогичнойсхемеэквиобъемное количество дистиллированной воды.Функциональное состояние почек у животных оценивалось по определению:- диуреза без нагрузки по общепринятому методу и с 2,5% водной нагрузкой [13];- концентрации катионов калия, натрия и кальция в моче – методом пламеннойфотометрии на приборе «Flapho-4» (Германия);- концентрации фосфора – по Хаями Тадаси [8];- концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови и моче –унифицированными методами с использованием наборов реактивов Био-Ла-Тест«Лахема» (Чехия);- концентрации белка в моче – по реакции с сульфосалициловой кислотой [75];- скорости клубочковой фильтрации – по клиренсу эндогенного креатинина;- рН мочи на универсальном иономере ЭВ-74 (Россия) с использованиемприспособления для малых объемов.Для определения минутного диуреза осуществляли сбор мочи в течение 3часов в обменных клетках, которые представляют собой металлические цилиндрыс перфорированным дном и воронкой, предназначенной для стока собираемоймочи.Для микроскопии мочевого осадка готовили микропрепарат из свежейпорции мочи путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин.

Затемнадосадочную жидкость удаляли, оставшийся осадок помещали на предметноестекло и рассматривали под микроскопом в 100 окнах при увеличении (×20) [76].Для определения концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови[123] и в гомогенате почек [168] была использована методика, основанная нареакции взаимодействия малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой и79последующем спектрофотометрировании образованного окрашенного комплексапри длине волны 532 нм и 580 нм.Спектрофотометрическимметодомопределялиактивностькаталазысыворотки крови [161].Полученныеэкспериментальныеданныестатистическиобработаныобщепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины(М) и средней ошибки (m).

Оценку значимости различий исследованийосуществляли с применением параметрического t-критерия Стьюдента. Различиясредних величин контроля и опытов считали существенными при вероятности 95%(Р≤0,05).2.5 Валидация методикВалидацию методик в объектах исследования проводили в соответствии суказаниями ГФ РФ XIII изд., ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитическихметодик» [27], согласно ГОСТу [25] и методическим указаниям [6, 100].Статистическуюобработкурезультатовисследованийпроводиливсоответствии с требованиями ГФ XI изд., вып. 1 и ГФ XIII изд., ОФС.1.1.0013.15«Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [27, 28].Статистическая обработка результатов анализа проводилась при n повторныханализов однородного материала, где:n– число измерений;xi– данные отдельных определений;nxxi1=nf=n–1– среднее значение из п определений;– число степеней свободы;ns2 =d1f2i– дисперсия;80 = √ 2 =√Рt (P, f)– средняя квадратичная ошибка отдельного определения(выборочное стандартное отклонение);– средняя квадратичная ошибка среднего арифметического илистандартное отклонение среднего результата;– коэффициент надежности (доверительная вероятность);– критерий Стьюдента, зависящий от надежности и числаопределений;∆х =± t (P, f) ∙ S – абсолютная ошибка результата отдельного определения;Е =±∆∙ 100%– относительная ошибка результата отдельного (единичного)определения81ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯРАСТИТЕЛЬНОГО СБОРА3.1 Разработка состава растительного сбораНесмотря на то, что большинство лекарственных растений обладаетмногосторонним действием, достичь хорошего клинического эффекта нередкоудается лишь при сочетании нескольких средств растительного происхождения.Применение растительных сборов в комплексе с другими лекарственнымисредствами и физиотерапией у больных мочекаменной болезнью в большинствеслучаев сопровождалось положительным лечебным эффектом.Предлагаемый нами состав растительного сбора был подобран с учетомизучения сведений об этиологии и патогенезе МКБ, опыте применения вофицинальной и народной медицине выбранных растений при терапии уролитиазаи данных о химическом составе их БАВ.В сбор растительный было включено сырье лекарственных растений сдиуретическим, спазмолитическим, антимикробным, противовоспалительным,иммуномодулирующим,антиоксидантнымиструктуру мочи действием.

Химическийнормализующимколлоиднуюсостав ЛРС отличен, поэтомуфармакологическая активность реализуется различными механизмами, чтопозволяет достичь комплексного действия.В состав сбора было предложено включить:- брусники листья с доказанной диуретической, противовоспалительной,антибактериальной и антиоксидантной активностью;- хвощаполевогопротивовоспалительной,травусдоказаннойантибактериальной,диуретической,литолитическойиантиоксидантной активностью;- лопуха корни с доказанным действием по предотвращению осаждениякристаллов в почках и антиоксидантной активностью;82- укропа пахучего плоды с доказанной диуретической, спазмолитической,противовоспалительной,антиоксидантнойиантибактериальнойактивностью;- полыниобыкновеннойтравусдоказаннойспазмолитической,болеутоляющей, противовоспалительной и антиоксидантной активностью.Также, одними из основных причин уролитиаза являются нарушения обменавеществ, инфекции мочевыводящих путей, хронические заболевания желудочнокишечного тракта, это также учитывалось при выборе компонентов сбора.Доля каждого вида лекарственного растительного сырья, рациональность ихсочетания определялись с учетом многоуровневого и многоэтапного механизмаразвития мочекаменной болезни.Все выбранное ЛРС давно используется в традиционной и официнальноймедицинекакмочегонное,спазмолитическое,антисептическое,противовоспалительное, желчегонное средство и имеет обеспеченную сырьевуюбазу.