Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, страница 12

Чтобы проанализировать продуктыгидролиза MBP протеасомой методом масс-спектрометрии, на первом этапе необходимобыло детализировать посттрансляционные модификации MBP, выделенного из головногомозга коровы, который планировалось использовать в качестве субстрата для протеолиза.Методом масс-спектроскопии ионного циклотронного резонанса с преобразованиемФурье с источником ионизации электроспрей (ESI-FTICR MS) было установлено, чтоМВР полностью ацетилирован и значительное количество белка монометилировано.Также МВР в пределах 10% от суммарного количества белка был диметилирован,фосфорилирован и окислен по остаткам метионина.

Сайты модификаций былиопределены методом протеолитической фрагментации MBP и анализом полученныхпептидов методом масс-спектрометрии с жидкостной хроматографией. Таким образом,основными посттрансляционными модификациями MBP являются ацетилирование Nконца, моно- и диметилирование остатков аргинина-106, фосфорилирование треонина-97,окисление метионина-19 и метионина-166 (Рис. 24).63Рисунок 24. Масс-спектрограмма мультизарядных ионов высокоочищенного MBP (вверху), подробнопоказан пик с зарядом +23 (внизу) и аминокислотная последовательность MBP c отмеченными на нейидентифицированными посттрансляционными модификациями.Процесс ферментативной деградации основного белка миелина может протекать подвум основным путям – с помощью протеасомы и протеаз. Чтобы выяснить, какотличается гидролиз MBP протеасомой в норме и патологии,мы провели in vitroгидролиз MBP протеасомами из головного мозга здоровых мышей и мышей, развивающихЕАЕ.

Для оценки качественного состава образующихся пептидов дополнительно намибыл проведен гидролиз МВР рядом протеолитических ферментов, которые, как полагают,ассоциированы с развитием рассеянного склероза [167]: матриксной металлопротеиназой3, матриксной металлопротеиназой 9, -кальпаином и трипсином. Продукты гидролизаанализировали методом тандем-масс-спектрометрии. Паттерны гидролиза протеасомой изголовногомозгамышейзначительноотличалисьотпаттерновгидролизапротеолитическими ферментами (Рис.

25А), а также от изученных ранее [94, 144]паттернов гидролиза каталитическими антителами. Под действием протеолитических64ферментов в основном образовывались пептиды, относящиеся к фрагменту MBP110-130, вто время как в гидролизатах протеасомой обнаруживались пептиды, относимыепрактическиковсейаминокислотнойпоследовательностиMBP.Извсехпротестированных протеолитических ферментов кальпаин наиболее близок к протеасомепо специфичности протеолиза MBP. Особо необходимо отметить, что спектры пептидов,образуемые под действием протеасомы из головного мозга здоровых и развивающих ЕАЕмышей, заметно отличаются друг от друга. Пептиды, полученные под действиемпротеасомы из головного мозга развивающих ЕАЕ мышей, существенно перекрывались сосновными Т-клеточными эпитопами MBP [167].Рисунок 25.

А. Паттерны деградации MBP протеасомами из головного мозга мышей, а также рядом протеаз,ассоциированных с развитием аутоиммунных патологий ЦНС. Сверху представлена аминокислотнаяпоследовательность MBP, каждая стрелка соответствует пептидному фрагменту этой аминокислотнойпоследовательности, детектируемому масс-спектрометрически. Толщина стрелок соответствует количествутого или иного пептида по результатам безметочного (label-free) анализа. Б.

Распределение по длинампептидов MBP, полученных под действием протеасомы из головного мозга мышей BALB/c, SJL и EAE-SJL.B. Безметочный анализ количества пептида ENPVVHFF (MBP83-90) в различных протеасомных гидролизатах.65Анализ распределения образуемых фрагментов МВР по длине показывает, чтомаксимальное количество пептидов длиной 8 аминокислотных остатков, оптимальной дляпрезентации на MHC I, получается под действием протеасомы из головного мозга мышей,развивающих ЕАЕ (Рис. 25Б).

Безметочный анализ количества пептида MBP83-90[ENPVVHFF] в протеасомных гидролизатах показал, что под действием протеасомы изголовного мозга мышей с EAE по сравнению со здоровыми мышами количество данногопептида возрастает в 10 раз (Рис. 25В).Проведенный безметочный анализ явно продемонстрировал необходимость строгоколичественного сравнения относительного содержания пептидов МВР в протеасомныхгидролизатах. Для этого был разработан метод, основанный на применении воды,содержащей нуклид кислорода 18О (Рис. 26). При каждом элементарном гидролитическомакте разрушения пептидной связи под действием протеасомы на С-конец образующегосяпептида встраивается атом кислорода из молекулы воды.

Протеолиз MBP протеасомой изголовного мозга мышей линии BALB/c проводили в воде, содержащей 18О, в то время какгидролиз протеасомой из мышей SJL проводили в обычной воде, содержащей16О. Такимобразом, пептиды, полученные при гидролизе MBP соответствующими протеасомами,будут отличаться друг от друга на 2 единицы молекулярной массы, но обладать вточности одинаковым временем удерживания на обращенно-фазовом сорбенте иодинаковой эффективностью ионизации.

Количество протеасомы, необходимой длягидролиза, выравнивали исходя из ее активности по пептидному субстрату Suc-Leu-LeuVal-Tyr-AMC.66Рисунок 26. Схематичное изображение метода количественно анализа паттернов деградации MBPпротеасомой с использованием воды, содержащей нуклид кислорода 18О.Для компенсации природного изотопного распределения13С/12С гидролизаты MBPдвумя типами протеасомы смешивали в нескольких разных молярных соотношениях. Этопозволило осуществить количественный анализ образования более чем 250 фрагментовMBP под действием протеасом из мышей линий BALB/c и SJL с и без ЕАЕ (Рис. 27). Изэтого количества 5 пептидов по структуре подходили для загрузки на MHC I. Количестводвух из этих пептидов, DTGILDSL (MBP33-40) and ENPVVHFF (MBP83-90) увеличивалось в10 раз при гидролизе MBP протеасомой из мозга EAE SJL в сравнении с гидролизом МВРпротеасомой из мозга мышей линии BALB/c. В отличие от других проанализированныхпептидов, согласно результатам MS2 спектра, MBP83-90 содержал на С-конце два атома 18Овместо одного.

Предположительно, это результат двойной реакции гидролиза, котораястановитсявозможнойврезультатеповышенногокаталитической полости протеасомы.67сродстваэтогопептидакРисунок 27. А. Пример участка масс-спектра, полученного при анализе с использованием воды,содержащей нуклид кислорода 18О. Б MS-MS спектр анализ пептидов ENPVVHFF, полученных поддействием протеасомы в воде, содержащей 16О и в воде, содержащей 18О.

В. Количественная оценканекоторых пептидов МВР, образующихся под действием протеасом. Данные пептиды которые по длинеподходят для загрузки на MHC I.Исследование образования пептида MBP83-90 под действием иммунопротеасомысубъединичного состава β1ihighβ5ilowПептид MBP83-90 является частью энцефалитогенного фрагмента MBP, поэтому мыболее детально изучили его образование при действии различных типов протеасомы наMBP. Для этого был синтезирован химически идентичный пептид с С-концевымфенилаланином, все атомы углерода и азота которого обладали массовыми числами 15 и13, соответственно.

Результаты количественного анализа с использованием подобноговнутреннего стандарта полностью подтвердили ранее полученные данные. Скорость68образованияпептидаMBP83-90,рассчитаннаяисходяизизвестногоколичествавнутреннего стандарта, заранее введенного в гидролизат МВР протеасомами, оказалась до8 раз больше при гидролизе MBP протеасомой из мозга EAE SJL, чем при гидролизепротеасомой из мозга неиммунизированных мышей линии SJL и мышей линии BALB/c(Рис.

28). За 24 часа под действием протеасомы из головного мозга EAE-SJL образуетсяпорядка 0.83 моль пептида ENPVVHFF на 1 моль изначального MBP.Рисунок 28. Определение скорости образования пептида ENPVVHFF с использованием синтетическогоизотопно-меченного аналога. Масс-спектр (А), зависимость количества образовавшегося пептида отвремени протеолиза (Б) и количество ENPVVHFF, образовавшегося за 24 часа гидролиза MBP протеасомойиз головного мозга мышей BALB/c, SJL и EAE SJL (в процентах от количества исходного MBP) (В).Свидетельство презентации пептида MBP83-90 на MHC I и анализ цитотоксическогодействия MBP83-90-специфических T-клеток на олигодендроциты.Возможность презентации того или иного пептида на поверхности клетки в составеMHC I обусловлена структурой пептид-связывающей области молекулы MHC I.

Излитературыизвестно[168],чтопептидDENPVVHFF(MBP82-90)способенkпрезентироваться на MHC I мыши гаплотипа H-2K . Однако, мыши линии SJL имеютгаплотип H-2s, поэтому нельзя с уверенностью сказать, будет ли генерируемыйиммунопротеасомой пептид MBP83-90 презентироваться на MHC I и вносить свой вклад вразвитие ЕАЕ у мышей линии SJL. Каждый тип молекулы MHC I взаимодействует сопределенным набором пептидов, имеющих определенные аминокислотные остатки в так69называемых «якорных сайтах», которые являются индивидуальной характеристикойкаждого отдельно взятого МНС I. В терминах девятичленного пептида якорные сайтымогут находиться в позициях P2-P9 или P5/6-P8.