Комплексы полиамфолитов с липидными мембранами - формирование, строение и свойства, страница 3

Chem. Res.; 39 (2006)702-710]. Для проверки способности полибетаинов вызывать структурные перестройки влипосомальной мембране мы использовали метод дифференциальной сканирующейкалориметрии. С его помощью можно анализировать фазовые переходы в липидном11бислое, что в свою очередь позволяет следить за микрофазовым разделением влипосомальноймембранеподдействиемполибетаинов.Липидныйбислойхарактеризуется температурой фазового перехода Тф.

Ниже температуры Тф липидныйбислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностью липидныхмолекул (“твердые” липосомы). При температуре выше Тф мембрана переходит вжидкокристаллическое состояние, и подвижность липидов в ней значительно возрастает(“жидкие” липосомы).Липосомы, приготовленные из природных липидов, ФХ и КЛ2-, характеризуютсяширокими фазовыми переходами в области температур, находящихся за пределамивозможностей традиционных микрокалориметров (Тф < 5ºС). Кроме того, оба образцапредставляют собой смеси липидов с различными температурами фазового перехода, чтоприводит к уширению калориметрической кривой и осложняет интерпретациюполученных результатов. Поэтому для калориметрических экспериментов липосомыготовили из смеси синтетических липидов: нейтрального ДПФХ и анионного ДОФГ1- с Тф= 41,5 и –20ºС соответственно.Как видно из Рис.

6, калориметрическая кривая смешанных ДПФХ/ДОПГ1липосом (Рис. 6, кривая 1) характеризуется фазовым переходом с пиком при 33,2 оС иплечомпри30оС.Полибетаиныдобавляликлипосомам,находящимсявжидкокристаллическом состоянии (при 55 оС) в соотношении [ПБ]/[ДОФГ1-] = 2,5, чтобыобеспечить участие всех молекул ДОФГ1- в образовании комплекса с полимером.Добавление раствора ПБ2 к суспензии липосом не сказывалось на положении и формекалориметрической кривой (ср. Рис. 6, кривые 1 и 2). Переход от ПБ2 к ПБ3сопровождался смещением калориметрической кривой в область более высокихтемператур, при этом пик фазового перехода становился более узким, хотя и оставался“двухкомпонентным” с максимумом при 34,8 и плечом при 36,4ºС (Рис.

6, кривая 3).Наконец, при добавлении ПБ4 регистрировался только один узкий пик (Рис. 6, кривая 4),который не менял своего положения при замене ПБ4 на ПБ5 (Рис. 6, кривая 5). Вприсутствии ПБ5 калориметрическая кривая полностью совпадала с кривой фазовогоперехода для липосом, сформированных только из нейтрального липида ДПФХ (ср. Рис.6, кривые 5 и 7).Смещение калориметрической кривой в сторону более высоких температурозначает появление в липосомальной мембране областей с повышенным содержаниемДПФХ по сравнению с усредненным его содержанием в мембране исходныхДПФХ/ДОФГ1-липосом.Этиобластимогутвозникнутьтольковрезультатеформирования кластеров, состоящих преимущественно из анионного ДОФГ1- благодаря12их взаимодействию с адсорбированными молекулами полибетаина.

Таким образом,связывание ПБ2 не вызывало латеральной сегрегации в мембране ДПФХ/ДОФГ1- липосом.Такое взаимодействие развивалось как адсорбция полибетаина на поверхности сфиксированным положением зарядов.7РисунокТеплоемкость, Дж/г/К5Калориметрическиекривые ДПФХ/ДОФГ1- липосом (1) и6,766.их смесей с ПБ2 (2), ПБ3 (3), ПБ4 (4),5ПБ5 (5), ПЭВП (6) и ДПФХ липосом43412(7).концентрациялипидов 3 мг/мл; [ПБ] = 1.5×10-3 М;32Суммарная110-2 М фосфатный буфер, рН 7,0;0скорость нагревания образцов 0.25-115град/мин.2025303540450T, CЧто касается ПБ4 и ПБ5, их адсорбция приводила к формированию фазы,состоявшей практически целиком из молекул нейтрального ДПФХ. Иными словами, этиполибетаиныобразовывалиэлектростатическийкомплекссовсемимолекуламианионного ДОФГ1-.

Ранее в литературе отмечали, что адсорбция поликатиона схожегостроения, поли-N-этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭВП) на поверхности смешанныхотрицательно заряженных липосом индуцирует переход анионных липидов с внутреннейстороны липосомальной мембраны на внешнюю (флип-флоп) [A.A.Yaroslavov et al., Acc.Chem. Res.; 39 (2006) 702-710]. Кривая теплоемкостилипосом в присутствии ПБ5совпадала с кривой в присутствии ПЭВП (Рис. 6, кривые 5 и 6). Это позволяет утверждать,что и полибетаин ПБ5 инициирует аналогичный процесс, в результате чего на внешнейстороне мембраны концентрируются все молекулы ДОФГ1-, изначально распределенныепо обеим сторонам бислоя.Кривая 3 (Рис.

6) для системы с участием ПБ3 занимает промежуточное положениемежду теми, которые описывают поведение комплексов липосом с ПБ2 и ПБ4/ПБ5. Инымисловами, адсорбция ПБ3 вызывала латеральную сегрегацию, однако в этом процессеучаствовали не все анионные липиды мембраны. По-видимому, адсорбция ПБ3индуцировала формирование кластеров лишь из молекул ДОФГ1- внешнего слоялипосомальной мембраны.13Таким образом, длина развязки –(СН2)n– в бетаиновой группировке оказываетрешающее влияние на способность полибетаина взаимодействовать с анионнымилипосомами и вызывать структурные перестройки в липосомальной мембране.

При n = 1полибетаин вообще не связывается с анионными липосомами, полибетаин с n = 2адсорбируется на мембране, не вызывая существенных структурных перестроек в бислое.В случае n = 3 адсорбция полибетаина индуцирует латеральную сегрегацию липидов вовнешнем слое мембраны. При n = 4 и 5 адсорбция полимера сопровождается латеральнойсегрегацией и флип-флопом липидных молекул, в результате чего в микрофазовомразделениипринимаютучастиевсеанионныелипидымембраны.Процессы,развивающиеся в смешанной системе полибетаин + анионная липосома, схематическипредставлена на Рис.

7.ПБ1Не взаимодействуетПБ2Адсорбция наповерхности липосомыcПБ4,5Адсорбция ииндуцирование латеральнойсегрегации и флип-флопаПБ3Адсорбция и индуцированиелатеральной сегрегацииРисунок 7. Реакция липосомальной мембраны на присутствие полибетаина.Говоря о возможном биомедицинском использовании полибетаинов, например, вкачестве носителей лекарственных веществ, следует иметь в виду, что биологическаясреда представляет собой водно-солевой раствор с концентрацией соли 0,15 М. Нашиэксперименты показали, что в этих условиях большинство исследованных полибетаиновне взаимодействует с анионными липосомами.

Единственным исключением является ПБ3,который необратимо связывается с анионной мембраной в концентрированных растворахсолей. По-видимому, это происходит благодаря особой геометрии бетаиновых групп ПБ314способных формировать шестичленные циклы, которые встраиваются в липидный бислойи стабилизируют комплекс ПБ3-липосома. Однако мы видим, что адсорбция ПБ3сопровождается появлением дефектов в липидном бислое и вытеканием содержимого излипосом в окружающий раствор.Для повышения стабильности комплексов в водно-солевых растворах можнопредложить, по крайней мере, два способа. Первый заключается в использованиисополимеров с бетаиновыми и катионными группами. Присутствие последних будетспособствоватьупрочнениюэлектростатическогосвязываниясополимеровсотрицательно заряженной липосомальной мембраной.

Второй способ – введение вмолекулу полибетаинов боковых алкильных заместителей. В этом случае стабильностькомплексов будет достигаться за счет встраивания алкильных «шпилек» в гидрофобнуючасть липидного бислоя.2. Комплексы ПБК и ПБЦ с анионными липосомами.Для апробации первого из описанных выше подходов была приготовлена сериясополимеров путем модификации поли-4-винилпиридина ω-бромпропионовой кислотой ибромистым этилом (ПБК, Таблица 1).

Доля катионных групп в сополимерах возрастает от0,16 (ПБК-1) до 0,63 (ПБК-5), соответственно доля бетаиновых групп в этом рядууменьшается от 0,8 до 0,33.РисунокФлуоресценция, о.е.1,08.Зависимостьотносительнойфлуоресценции2-0,8меченных КЛ /ФХ липосом отконцентрации ПБ2 (1), ПБК-1 (2),5,60,63,41ПБК-2 (3), ПБК-4 (4), ПБК-5 (5) и2ПЭВП (6).

Общая концентрация0,4липидов1мг/мл,10-2Мборатный буфер, рН 9,2.0,20510154[Полиэлектролит]*10 , МДобавление всех ПБК-сополимеров к суспензии флуоресцентно меченых ДПФЭНБД ФХ/КЛ2- липосом сопровождалось тушением флуоресценции, что однозначно15указывает на их связывание с анионными липосомами (Рис. 8).

Увеличение доликатионного компонента в сополимере повышало эффективность тушения метки, и дляПБК-5 с долей катионных групп α = 0,63 она становилась сопоставимой с таковой дляполикатиона ПЭВП.Последующее добавление раствора NaCl к суспензиям комплексов приводило квозгоранию флуоресценции (Рис. 9), то есть к диссоциации комплексов, так же, как этонаблюдалось для комплексов анионных липосом с полибетаинами. Все комплексыпрактически полностью диссоциировали на исходные компоненты при физиологическомзначении концентрации соли (0,15 М).1,1РисунокФлуоресценция, о.е.1,020,8Зависимостьотносительной10,99.3комплекса4меченные50,7флуоресценцииПолиэлектролитКЛ2-/ФХ-липосомыконцентрацииотNaCl.-40,6[Полиэлектролит]= 2,5 ×10 М.

ПБ20,5Физиологическая (1), ПБК-1 (2), ПБК-2 (3), ПБК-5 (4) иПЭВП (5). Общая концентрация0,40,30,00липидов 1 мг/мл, 10-2 М боратный0,05Второйгидрофобизация0,10 0,15 0,20[NaCl], Mподходк0,25стабилизацииполибетаина,был0,3буфер, рН 9,2.комплексовреализовансвводно-солевойиспользованиемсреде-сополимеров,полученных модификацией поли-4-винилпиридина ω-бромпропионовой кислотой ибромистым цетилом (ПБЦ, Таблица 1). Обработка бромистым цетилом позволила ввестив макромолекулу боковые алкильные радикалы и одновременно придала полимерной цепиизбыточный положительный заряд, как и в случае ПБК. Поэтому полиамфолиты серииПБЦ можно рассматривать как гидрофобизованный варианты полимеров, содержащихбетаиновые и катионные группы.