Структура и свойства хитозановых плёнок и покрытий, получаемых из растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением, страница 3

Если прямым осаждением из растворов в ск СО2 нам удавалосьполучать лишь субмономолекулярные покрытия, для исследования которых нужнобыло привлекать высокочувствительный метод АСМ, то обнаруженная гораздоболее высокая растворимость хитозана в угольной кислоте позволяла осаждатьсущественно более плотные однородные покрытия, присутствие которых наподложке можно было детектировать и с использованием гораздо менеечувствительных методов. Действительно, даже гравиметрически, а также спомощью метода меченых атомов (исследование проведены к.х.н Бадуном Г.А,к.х.н Чернышевой М.Г., химический факультет МГУ), было обнаруженоинтегральное количество хитозана, осаждаемое из раствора с концентрациейполимера 10 г/л в угольной кислоте на коллагеновую матрицу, что составило(1,0±0,1)% от веса матрицы. Погрешность в приведенном значении получена12методом меченных атомов, гравиметрия даёт существенно большие погрешности.Оказалось, что, несмотря на такие малые количества вводимого хитозана всравнении с весом матрицы, вся толща матрицы было модифицирована хитозаном,что было подтверждено ПЭМ изображениями её срезов (изображения полученыАбрамчуком С.С., к.т.н.

с.н.с физического факультета МГУ) (см.рис.3).б)a)Рис.3. Сравнительный анализ ПЭМ изображений ультратонких срезов а) коллагеновых матрицс хитозановым покрытием, нанесенным из растворов угольной кислоты (P=30 МПа, Т=25ᵒС,времяэкспозиции —3 часа, концентрация хитозана 10 г/л) б) коллагеновой матрицы перикарда снанесенным хитозановым покрытием из раствора уксусной кислоты (20 г/л). Присутствуютнаночастицы серебра в качестве маркера хитозановой фазыТакже была исследована поверхность матрицы с помощью СЭМ (изображенияполучены Кашиным А.С., аспирант ИОХ РАН), в результате было детектированоизменение особенностей морфологии поверхности, что обусловлено покрытием еёхитозаном слоем толщиной порядка несколько десятков нанометров, которыйобеспечивает ее локальную гладкость (см рис.4). Кроме того, процесс нанесенияхитозана из угольной кислоты, в силу высокого давления этого растворителя,13приводил к изменению внутренней структуры матрицы, что проявлялось всхлопывании её пор и связывании их стенок хитозаном, и приводило кдетектируемому улучшению механико-прочностных свойств коллагеновойматрицы, несмотря на столь малые количества вводимого хитозана.Была определена степень адгезии некоторых клинических штаммов бактерий(были выбраны бактерии, чаще всего вызывающие осложнения в организмечеловека после хирургической операции по замену биопротезного клапана сердца)к коллагеновой матрице перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным изугольной кислоты (эксперименты проведены Лютовой И.Г, врачом-бактериологомлаборатории производства биопротезов, Анучиной Н.М, м.н.с.

лабораториимикробиологии и антибиотикотерапи в ЦССХ им. А.Н. Бакулева).×25000×25000×50000×50000б)a)Рис.4. Сравнительный анализ СЭМ изображений поверхности a) коллагеновой матрицыперикарда находившейся в чистой угольной кислоте без хитозана (P=30 МПа, Т=25ᵒС,времяэкспозиции —3 часа) и б) коллагеновой матрицы перикарда с нанесенным хитозановымпокрытием из раствора угольной кислоты (P=30 МПа, Т=25ᵒС,время экспозиции —3 часа,концентрация хитозана — 10г/л). Увеличение, сверху вниз:×25000, ×5000014Из анализа полученных результатов, суммированных в табл. 1, можно сделатьвывод, что хитозановое покрытие на коллагеновой матрице перикарда, нанесенноеиз растворов в угольной кислоте, имеет абсолютные антиадгезивные свойства поотношению к грамположительным бактериям.

Однако, сохраняется некотораяадгезия грамотрицательных бактерий к поверхности коллагеновой матрицы схитозановым покрытием, нанесенным из растворов угольной кислоты, хотя и надва порядка меньшая, чем для исходной нативной коллагеновой матрицыперикарда.Такоезначительноеснижениестепениадгезииматрицмодифицированных в угольной кислоте, обусловлено возникновением локальноболее гладкой поверхностью контакта, в сравнении с поверхностью контрольнойколлагеновой матрицы, в результате экстракции в угольной кислоте частиклеточного материала перикарда. Это приводит к наличию лишь вандерваальсовавзаимодействия и водородного связывания между клеткой бактерии иповерхностью матрицы, в то время как лиганд-рецепторное взаимодействие склеточнымматериаломперикарда,обусловленноеэлектростатическимвзаимодействием, фактически полностью исключается.Табл.

1. Индекс адгезии и степень адгезии некоторых клинических штаммов бактерий к: 1)образцу перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из угольной кислоты 2)сравнительному образцу перикарда обработанного в чистой угольной кислоте без хитозана 3)образцу сравнения исходного нативного перикарда.Тестовые культуры, концентрация 106 клеток/млГрамположительныеГрамотрицательныеS. AureusS. HaemolyticusPs.

AeruginosaE.coli (Кишечная(Стафилококк(Стафилококк(Синегнойнаяпалочка)золотистый)гемолитический)палочка)ИА,СтA,ИА,СтA,ИА,СтA,ИА,СтA,клеток/cм2%клеток/c%клеток/cм2%клеток/cм2%2мКоллагеновые матрицы перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворовугольной кислоты без хитозана00002,0×1032,03,0×1033,0Коллагеновые матрицы перикарда, обработанные в чистой угольной кислоте без хитозана1,5×1031,55,5×1035,52,0×1020,23,4×1020,34Контрольные коллагеновые матрицы исходного нативного перикарда105100105100105100105100Детектированное абсолютное отсутствие грамположительных бактерий наколлагеновых матрицах, покрытых хитозаном, по-видимому, объясняетсяуничтожением адгезированных бактерий, вследствие разрыва клеточной стенки,под действием напряжений, вызываемых водородными связями, непосредственновозникающими между клеточной стенкой и хитозановым покрытием, на фоне15возможного дополнительного вклада электростатического взаимодействиязаряженных элементов клеточной стенки с остаточными протонированнымиаминогруппами хитозана.Присутствие грамотрицательных бактерий на коллагеновых матрицах схитозановым покрытием, по-видимому, обусловлено адгезией этих бактерий кповерхности хитозана с сохранением нативного состояния.

Наличие некоторойадгезии грамотрицательных бактерий к коллагеновой матрице покрытой хитозаномможет объясняться возникновением водородных связей между хитозаном игруппами О-антигена липополисахарида (ЛПС) грамотрицательных бактерий,имеющим в своем составе большое количество ОН групп, и функциональнымигруппами хитозана –NH2 и –OH. Наличие водородных связей между ЛПС ихитозановым покрытием в этом случае не приводит к разрыву клеточной стенкибактерий в связи с локальной удаленностью ЛПС от основной клеточной стенки, врезультате напряжения, вызванные водородными связями, прикладываются к вбольшей степени гибким цепям ЛПС, что позволяет клеточным стенкам бактерийвыдерживать более сильные напряжения.Был проведен анализ биосовместимых свойств коллагеновой матрицы перикардас хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте спомощью модельной системы: определения степени реакции клеток фибробластовмыши на экстракты коллагеновых матриц (эксперименты проведены Бакулевой Н.П, к.х.н., заведующей лаборатории производства биопротезов в ЦССХ им.

А.Н.Бакулева).Испытания показали, что экстракты из образцов исходной коллагеновойматрицы нативного перикарда в эксперименте имели небольшое цитотоксическоевоздействие, что, вероятно, связано с влиянием глутарового альдегида, состаточными,непрореагировавшимифункциональнымигруппами,экстрагированного из матриц, который вызывает некоторый лизис клеток.Экстракты из образцов коллагеновой матрицы перикарда с хитозановымпокрытием, нанесенным из угольной кислоты, не имеют какого-либоцитотоксического воздействия, что, по-видимому, связано с экстрагированием изматриц лишь глутарового альдегида с полностью прореагировавшими группами,например, ковалентно связанными с хитозаном, который не вызывает лизис клетоквследствие биосовместимости хитозана.

Таким образом, существенное увеличениебиосовместимости коллагеновой матрицы перикарда происходит за счетковалентного связывания хитозана с цитотоксичными остаточными свободными16группами глутарового альдегида на фоне абсолютной биосовместимостивозможных остаточных следов растворителя — угольной кислоты.Было обнаружено, что хитозановое покрытие, нанесенное на коллагеновуюматрицу перикарда методом прямого осаждения хитозана из растворов в угольнойкислоте, рекордно подавляет процесс кальцификации коллагеновой матрицы(эксперименты проведены Бакулевой Н. П, к.х.н., заведующей лабораториипроизводства биопротезов в ЦССХ им.