Кинетическое моделирование системы фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов, страница 3
Описание файла
PDF-файл из архива "Кинетическое моделирование системы фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "физико-математические науки" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
Äëÿ îöåíêèýôôåêòèâíîñòè ðàáîòû ÀÍÒ áûëî èçó÷åíî îòíîøåíèå êîëè÷åñòâà ïåðåíåñåííûõ ìîëåêóë ÀÄÔ ê ïîëíîìó ÷èñëó îáîðîòîâ ïåðåíîñ÷èêà. Ðàññ÷åò ïîêàçàë, ÷òî ýôôåêòèâíîñòü ðàáîòû ÀÍÒ íå ïðåâûøàåò 0,5 äàæå ïðè âûñîêèõ çíà÷åíèé ïîòåíöèàëà. Ó÷åò ìíîæåñòâåííîñòè ôîðì àäåíèëàòîâ (M g 2+ ,H + -ñâÿçàííûå ôîðìû) ïîçâîëèë îöåíèòü âëèÿíèå pH íà ñêîðîñòü ïåðåíîñà àäåíèëàòîâ ðèñ.4. Ñðàâíåíèå ïîñòðîåííîé ìîäåëè ñ ïðî÷èìè ìîäåëÿìèÀÍÒ èç ëèòåðàòóðû ïîêàçàë, ÷òî íàøà ìîäåëü òî÷íåå îïèñûâàåò ïåðåíîñ÷èê êàê ïî âåëè÷èíå íåâÿçêè, òàê è ïî êðèòåðèþ Àêàèêå.-112400 ,4180 мВАЭффективностьVexch, мин80,20-4- 0, 2АДФout, мкМ-120Δψ, мВ06 ,526 ,486 ,44-1Vexch, мин6420-2-4-6-8-10010 20 30 40 50 60 70 80-0,4Б4080120160-10 мВVexch, мин-8ВГpHo6 ,406 ,36Δψ, мВ4080120160pHi6 ,32pH7,27,67,8Ðèñ. 4. À) Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè îáìåíà ÀÒÔ/ÀÄÔ îò êîíöåíòðàöèèâíåøíåé ÀÄÔ ïðè ðàçëè÷íûõ çíà÷åíèÿõ ïîòåíöèàëà íà ìåìáðàíå.
Á)Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè îáìåíà ÀÒÔ/ÀÄÔ îò ïîòåíöèàëà íà ìåìáðàíå.Â) Çàâèñèìîñòü ýôôåêòèâíîñòè îáìåíà ÀÒÔ/ÀÄÔ (îòíîøåíèå ñêîðîñòè îáìåíà ê ïîëíîìó ÷èñëó îáîðîòîâ) îò ïîòåíöèàëà íà ìåìáðàíå.Ã) Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè îáìåíà ÀÒÔ/ÀÄÔ îò âåëè÷èíû pH âíóòðè èñíàðóæè ìèòîõîíäðèè. Êàæäàÿ êðèâàÿ îòðàæàåò èçìåíåíèå çíà÷åíèÿâ îäíîì èç êîìïàðòìåíòîâ ïðè ôèêñèðîâàííîé pH â äðóãîì.Ðàçäåë 3.3. ïîñâÿùåí ïîñòðîåíèþ ìîäåëè H+ -ÀÒÔ-ñèíòàçû. Ìîäåëüâêëþ÷àåò â ñåáÿ êàê îïèñàíèå ìåõàíèçìà ÷åðåäîâàíèÿ ñðîäñòâà â êàòàëèòè÷åñêèõ öåíòðàõ, òàê è ïðîöåññ âåêòîðíîãî ïåðåíîñà ïðîòîíîâ ÷åðåç âíóòðåííþþ ìåìáðàíó ìèòîõîíäðèè.
Ðÿä ýêñïåðèìåíòàëüíî îáîñíîâàííûõ ïðèáëèæåíèé ïîçâîëèë óïðîñòèòü âûâîä ôóíêöèè ñêîðîñòè ñèíòåçà/ãèäðîëèçàÀÒÔ. Âëèÿíèå âåêòîðíîãî ïåðåíîñà ïðîòîíîâ íà íàïðàâëåíèå è ñêîðîñòüðàáîòû ÀÒÔ-ñèíòàçû ó÷èòûâàëîñü ïóòåì ðàññìîòðåíèÿ ñòàòèñòè÷åñêîãîàíñàìáëÿ γ -ñóáúåäèíèö, ñâÿçàííûõ ñ êîëüöîì c-ñóáúåäèíèö. Áûëà âûâåäåíà ôóíêöèÿ ðàñïðåäåëåíèÿ (ñì. ðèñ. 5) ïî ýíåðãåòè÷åñêèì ñîñòîÿíèÿì ñóáúåäèíèö â çàâèñèìîñòè îò óãëà ñêðó÷èâàíèÿ óïðóãîãî ñòåðæíÿ γ ñóáúåäèíèöû, à çàòåì ïðîèçâåäåí ïåðåõîä îò õàðàêòåðèñòèê ìèêðîñîñòîÿíèé ê âåëè÷èíå êîíñòàíòû ñêîðîñòè ðåàêöèè ñèíòåçà/ãèäðîëèçà, ïóòåìóñðåäíåíèÿ âñåõ âîçìîæíûõ ïåðåõîäîâ èñõîäÿ èç ôóíêöèè ðàñïðåäåëåíèÿ.Èñõîäÿ èç êèíåòè÷åñêèõ è ñòðóêòóðíûõ äàííûõ î ôóíêöèîíèðîâàíèèÀÒÔ-ñèíòàçû è ñõåìû Áîéåðà ÷åðåäóþùåãîñÿ ñðîäñòâà íàìè áûë ïîñòðî-13fφÐèñ.
5. Âèä ôóíêöèè ðàñïðåäåëåíèÿ ñîñòîÿíèé óïðóãèõ ñòåðæíåé ïîóãëàì ñêðó÷èâàíèÿ.åí êàòàëèòè÷åñêèé öèêë ôåðìåíòà (ñì. ðèñ. 6). Ñ èñïîëüçîâàíèåì ðÿäàïðèáëèæåíèé äëÿ áûñòðûõ ñòàäèé êàòàëèçà, ìåòîäîì Êèíãà-Àëüòìàíà áûëà âûâåäåíà ôóíêöèÿ ñêîðîñòè ñèíòåçà ÀÒÔ. Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè êàòàëèçà îò ïîòåíöèàëà ìåìáðàíû è ðàçíîñòè pH ó÷èòûâàëîñü ÷åðåç èçìåíåíèå êîíñòàíòû ñêîðîñòè, ÷òî áûëî îïèñàíî âûøå.  èòîãå áûëà âûâåäåíàôóíêöèÿ ñêîðîñòè, ñîäåðæàùàÿ ñåìü íåçàâèñèìûõ ïàðàìåòðîâ, êîòîðûåìû èäåíòèôèöèðîâàëè èñõîäÿ èç ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ ïî êèíåòèêåÀÒÔ-ñèíòàçû, íàéäåííûõ â ëèòåðàòóðå /2/. Ñ ïîìîùüþ ÷èñëåííûõ ìåòîäîâ èäåíòèôèêàöèè ïàðàìåòðîâ óäàëîñü äîáèòüñÿ õîðîøåãî ñîîòâåòñòâèÿìåæäó ýêñïåðèìåíòàëüíûìè äàííûìè è ðåçóëüòàòàìè ìîäåëèðîâàíèÿ, ÷òîïîêàçàíî íà ðèñ.
7. Îñíîâûâàÿñü íà îöåíêå ïàðàìåòðîâ, ìîæíî çàêëþ÷èòü,÷òî êîíñòàíòû ñêîðîñòè äèññîöèàöèè ÀÒÔ è ÀÄÔ â äâóõ êàòàëèòè÷åñêèõöåíòðàõ èìåþò îäèíàêîâûé ïîðÿäîê. Êîíñòàíòà äèññîöèàöèè äëÿ ÀÒÔ âòðè ðàçà áîëüøå, ÷åì äëÿ ÀÄÔ. Êðîìå òîãî ïîêàçàíî, ÷òî ïîòåíöèàë ìåìáðàíû âëèÿåò êàê íà ñêîðîñòü ãèäðîëèçà, òàê è íà ñèíòåç ÀÒÔ ïðè ëþáûõôèçèîëîãè÷åñêèõ óñëîâèÿõ.Ïðåäñêàçàíèÿ ïîñòðîåííîé ìîäåëè, ïðè ïàðàìåòðàõ, áëèçêèõ ê ôèçèîëîãè÷åñêèì, èçîáðàæåíû íà ðèñóíêå 8. Ñ ïîìîùüþ äàííîãî ìîäåëèðîâàíèÿ óäàëîñü ïîêàçàòü, ÷òî ïðè çíà÷åíèÿõ ÀÄÔ âûøå 5 ìÌ ñêîðîñòüðàáîòû ÀÒÔ-ñèíòàçû èçìåíÿåòñÿ íåçíà÷èòåëüíî. Êðîìå òîãî, èç ãðàôèêîââèäíî, ÷òî ïðè çíà÷åíèÿõ êîíöåíòðàöèé Pi îò 10 ìÌ è âûøå, ñêîðîñòü ñèí-14Ðèñ.
6. Êàòàëèòè÷åñêèé öèêë, èñïîëüçóåìûé äëÿ âûâîäà ôóíêöèè ñêîðîñòè ÀÒÔ-ñèíòàçû.20010021503500050210,511001,000,501,02002150110050000,51,0Ðèñ. 7. Ñðàâíåíèå ðåçóëüòàòîâ ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ èç ðàáîòû /2/ è ìîäåëèðîâàíèÿ ïîñëå èäåíòèôèêàöèè ïàðàìåòðîâ.Pi = 20 мМvSYNАДФ, мМ12vSYN0160140120100806040200-20АPi = 10 мМ60160140120100806040200Pi, мМ051010160В140pHo12010080pHi604020ΔΨ, мВ0100 120 140 160 1807,23456789Б15202530803540ГvSYN160140120100806040vSYN15pH7,67,8Ðèñ. 8. À) Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè ñèíòåçà ÀÒÔ îò êîíöåíòðàöèè ÀÄÔïðè ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ íåîðãàíè÷åñêîãî ôîñôàòà. Çíà÷åíèÿ ïàðàìåòðîâ: pHi = 7, 8; pHo = 7, 2; M g 2+ = 0, 32 ìÌ; Ti = 10mM − Di ;∆ψ = 180 ìÂ.
Á) Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè ñèíòåçà ÀÒÔ îò êîíöåíòðàöèèPi. Çíà÷åíèÿ ïàðàìåòðîâ: pHi = 7, 8; pHo = 7, 2; M g 2+ = 0, 32 ìÌ;Ti = 3 ìÌ; Di = 7; ∆ψ = 180 ìÂ. Â) Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè ñèíòåçàÀÒÔ îò âåëè÷èíû pH. Çíà÷åíèÿ ïàðàìåòðîâ: pHi = 7, 8; pHo = 7, 2;M g 2+ = 0, 32 ìÌ; Ti = 3 ìÌ; Di = 7; P i = 20 ìÌ; ∆ψ = 180 ìÂ. Ã)Çàâèñèìîñòü ñêîðîñòè ñèíòåçà ÀÒÔ îò âåëè÷èíû ýëåêòðè÷åñêîãî ïîòåíöèàëà. Çíà÷åíèÿ ïàðàìåòðîâ: pHi = 7, 8; pHo = 7, 2; M g 2+ = 0, 32ìÌ; Ti = 3 ìÌ; Di = 7; P i = 20 ìÌ.òåçà ïðàêòè÷åñêè íå èçìåíÿåòñÿ.
Ãðàôèêè 8Â,à ïîêàçûâàþò, ÷òî êàê ýëåêòðè÷åñêèé ïîòåíöèàë, òàê è ðàçíîñòü pH âëèÿþò íà ñêîðîñòü ãèäðîëèçà èñèíòåçà âî âñåì äèàïàçîíå óñëîâèé.  ðàçäåëå 3.4. ïðèâîäèòñÿ ïîñòðîåíèåñòàöèîíàðíîé ìîäåëè ôîñôàòíîãî ïåðåíîñ÷èêà ìèòîõîíäðèè.Ðàçäåë 3.5. ïîñâÿùåí îïèñàíèþ îáúåäèíåííîé ìîäåëè ñèñòåìû ôîñôîðèëèðîâàíèÿ ìèòîõîíäðèè, âêëþ÷àþùåé â ñåáÿ àäåíèííóêëåîòèäòðàíñëîêàçó, H+ -ÀÒÔ-ñèíòàçó, ôîñôàòíûé ïåðåíîñ÷èê, à òàêæå ïðîöåññû îáðàçîâàíèÿ ðàçëè÷íûõ ôîðì ìåòàáîëèòîâ.
Ñõåìà íà ðèñ. 9 ïðåäñòàëÿåò ñîáîé ìåòàáîëè÷åñêóþ êàðòó âçàèìîäåéñòâèé ðàçëè÷íûõ ó÷àñòíèêîâîïèñûâàåìîé ñèñòåìû. Íà îñíîâå ïðèâåäåííîé ñõåìû è âûáðàííûõ ðàíåå ïðèáëèæåíèé áûëà ñîñòàâëåíà ñèñòåìà äèôôåðåíöèàëüíûõ óðàâíåíèé,îïèñûâàþùèõ çàâèñèìîñòü êîíöåíòðàöèé ìåòàáîëèòîâ îò âðåìåíè. Êðîìåîïðåäåëåííûõ â ïðåäûäóùèõ ðàçäåëàõ ïàðàìåòðîâ, ñèñòåìà ñîäåðæèò äâàíåèçâåñòíûõ ïàðàìåòðà àêòèâíîñòè àäåíèííóêëåîòèä-òðàíñëîêàçû è H+ ÀÒÔ-ñèíòàçû, êîòîðûå íåîáõîäèìî áûëî îïðåäåëèòü èñõîäÿ èç ýêñïåðèìåí-16межмембранное пространство(MgHPO4)o2-(HPO4 )oHMgo2+HH+o3-+o-(H2PO4 )oHo+2+2oMgATPMgo2+4-3-ATPo+-MgATPiHi+2-3HiMgADPoАНТMgi2+Mgi2+(H2PO4 )i-ADPoH -АТФ-синтазаHi+(MgHPO4)iHADPo+oMgo3Ho+фосфатныйпереносчикHi+2-HATPoATPi2-4-ADPi(HPO4 )iHATPiMgi2+MgADPi-Hi+Hi++3-3-HADPi2-матриксÐèñ.
9. Ñõåìà äëÿ îïèñàíèÿ ñèñòåìû ôîñôîðèëèðîâàíèÿ ìèòîõîíäðèè,èñïîëüçóåìàÿ äëÿ ïîñòðîåíèÿ ìîäåëè. Íà ñõåìà óêàçàíû òàêæå ïðîöåññû îáðàçîâàíèÿ ìàãíèåâûõ è ïðîòîíèðîâàííûõ ôîðì ìåòàáîëèòîâ.òàëüíûõ äàííûõ. Òàêèå ýêñïåðèìåíòàëüíûå äàííûå áûëè ïîëó÷åíû íàìèâ ñîòðóäíè÷åñòâå ñ ëàáîðàòîðèåé íåéðîáèîõèìèè Óíèâåðñèòåòà Áóäàïåøòàâ Âåíãðèè ïîä ðóêîâîäñòâîì Â. Àäàì-Âèçè.
Èñïîëüçîâàííàÿ îðèãèíàëüíàÿýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ìåòîäèêà ïîçâîëÿåò ïðîâîäèòü èçìåðåíèÿ êîíöåíòðàöèé ÀÒÔ, ÀÄÔ è ïîòåíöèàëà ìåìáðàíû â ðåæèìå ðåàëüíîãî âðåìåíè. Âèòîãå óäàëîñü ïîëó÷èòü äàííûå, ïðåäñòàâëåííûå íà ðèñóíêå 10, ãäå ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòîâ ñ ðàçîáùèòåëåì è èíãèáèòîðîì ÀÍÒ.Èñïîëüçóÿ ÷èñëåííûå ìåòîäû, óäàëîñü îïðåäåëèòü íåèçâåñòíûå ïàðàìåòðûóðàâíåíèÿ. Ñðàâíèòü, íàñêîëüêî ðåçóëüòàòû ìîäåëèðîâàíèÿ ïîñëå èäåíòèôèêàöèè ïàðàìåòðîâ ñîîòâåñòâóþò ýêñïåðèìåíòàëüíûì äàííûì ìîæíî íàðèñóíêå 10. Èñõîäÿ èç ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ óäàëîñü îïðåäåëèòü àêòèâíîñòü ÀÍÒ, äëÿ ÀÒÔ-ñèíòàçû óäàëîñü íàéòè òîëüêî íèæíþþ ãðàíèöóàêòèâíîñòè.
Òàêèì îáðàçîì, íàìè áûëà ÷èñëåííî îïèñàíà ñèñòåìà ôîñôîðèëèðîâàíèÿ ìèòîõîíäðèè ãåïàòîöèòà êðûñû. Ñ ó÷åòîì ëèòåðàòóðíûõ äàííûõ î êîýôôèöèåíòàõ óïðàâëåíèÿ äëÿ ÀÍÒ è ÀÒÔ-ñèíòàçû è èñïîëüçóÿäàííóþ ñèñòåìó ìîæíî ñäåëàòü êîëè÷åñòâåííûå ïðåäñêàçàíèÿ ïîâåäåíèÿñèñòåìû â óñëîâèÿõ, áëèçêèõ ê ôèçèîëîãè÷åñêèì. Ðåçóëüòàòû ìîäåëèðîâàíèÿ ïðåäñòàâëåíû íà ðèñóíêå 11. Ñ ïîìîùüþ ìîäåëèðîâàíèÿ çàâèñèìîñòè-1170,5АБvATP, мМ мин-1 мг-1-1VATP, мМ мин мг0,80,70,60,50,40,30,20,101000,40,30,20,1СATR, нМΔΨ, мВ0110120130140150160170050166162150200250300350400ВΔΨ, мВ170100158154150CATR, мМ146050100150200250300350400Ðèñ. 10. Ñðàâíåíèå ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ è ðåçóëüòàòîâ ìîäåëèðîâàíèÿ ñèñòåìû ôîñôîðèëèðîâàíèÿ ìèòîõîíäðèè ïîñëå îïðåäåëåíèÿ ïàðàìåòðîâ.
À) Çàâèñèìîñòü ñòàöèîíàðíîé ñêîðîñòè îáðàçîâàíèÿÀÒÔ â çàâèñèìîñòè îò ïîòåíöèàëà ìåìáðàíû (ýêñïåðèìåíò ñ ðàçîáùèòåëåì). Á) Çàâèñèìîñòü ñòàöèîíàðíîé ñêîðîñòè îáðàçîâàíèÿ ÀÒÔâ çàâèñèìîñòè îò êîëè÷åñòâà ðàçîáùèòåëÿ cATR. Â) Çàâèñèìîñòü ïîòåíöèàëà ìåìáðàíû îò êîëè÷åñòâà ðàçîáùèòåëÿ.âûõîäà ÀÒÔ èç ìèòîõîíäðèè ïðè ôèêñèðîâàííûõ êîíöåíòðàöèÿõ âíåìèòîõîíäðèàëüíûõ ìåòàáîëèòîâ (ðèñ.
11À) óäàëîñü ïîêàçàòü, ÷òî òîëüêî ïðèçíà÷åíèè ïîòåíöèàëà áîëåå 100 ì íàáëþäàåòñÿ ñèíòåç ÀÒÔ. Ïðè ìåíüøèõ çíà÷åíèÿõ íàáëþäàåòñÿ ãèäðîëèç ÀÒÔ, íåçàâèñèìî îò çíà÷åíèÿ àêòèâíîñòè ÀÒÔ-ñèíòàçû. Âåëè÷èíà ðàçíîñòè pH âëèÿåò íà ñêîðîñòü ñèíòåçàÀÒÔ â äèàïàçîíå ∆Ψ îò 60 äî 160 ìÂ, ïîñêîëüêó ïðè áîëüøèõ çíà÷åíèÿõôîñôîðèëèðîâàíèå îïðåäåëÿåòñÿ èñêëþ÷èòåëüíî ñêîðîñòüþ ðàáîòû ÀÍÒ,íà êîòîðóþ ðàçíîñòü pH âëèÿåò íåçíà÷èòåëüíî. Ïðè âîçðàñòàíèè âíåøíåé ýíåðãåòè÷åñêîé íàãðóçêè (ÀÄÔ/ÀÒÔ) ñêîðîñòü ñèíòåçà çíà÷èòåëüíîóâåëè÷èâàåòñÿ, ÷òî îáúÿñíèìî ñ òî÷êè çðåíèÿ ôèçèîëîãèè êëåòêè. Äåéñòâèòåëüíî, âûñîêèå êîíöåíòðàöèè ÀÄÔ â êëåòêå ìîãóò áûòü îïàñíû, ÷åãîìèòîõîíäðèÿ ïûòàåòñÿ èçáåæàòü, óâåëè÷èâàÿ ñêîðîñòü ãèäðîëèçà.Êðîìå òîãî, áûëà ïîñòðîåíà çàâèñèìîñòü êîíöåíòðàöèè âíóòðåííèõàäåíèëàòîâ îò ýíåðãèçàöèè ìèòîõîíäðèè. Ðàíåå, êîíöåíòðàöèè ìåòàáîëèòîâ ïûòàëèñü ïîëó÷èòü ýêñïåðèìåíòàëüíî, îäíàêî, ïîñêîëüêó ñîîòíîøåíèåÀÒÔ/ÀÄÔ â ìàòðèêñå ñëîæíî èçìåðèòü ýêñïåðèìåíòàëüíî, áûëè ïîëó÷åíû äîâîëüíî ïðîòèâîðå÷èâûå äàííûå.
