Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов
Описание файла
PDF-файл из архива "Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "физико-математические науки" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
На правах рукописиПРОТОПОПОВА Анна ДмитриевнаАТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯБИОМАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВСпециальность 02.00.06 ― высокомолекулярные соединенияАвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидатафизико-математических наукМосква – 2012Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристалловфизического факультета Московского Государственного Университета имениМ.В.Ломоносова.Научный руководитель:доктор физико-математических наукЯминский Игорь Владимирович.Официальные оппоненты:доктор физико-математических наукпрофессорШайтан Константин Вольдемарович,кандидат физико-математических наукВедущая организация:Клинов Дмитрий Владимирович.Институт общей физики имени А.М.Прохорова РАН.Защита состоится 13 февраля 2013 г в 17 час. 00 мин.
на заседаниидиссертационного совета Д 501.002.01 при Московском государственномуниверситете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва,Ленинские горы, д. 1, стр. 35, Центр коллективного пользования МГУ,конференц-зал.С диссертацией можно ознакомиться в Отделе диссертаций Научнойбиблиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова (Ломоносовский просп., д. 27).Автореферат разослан 28 декабря 2012 г.Ученый секретарьдиссертационного советакандидат физико-математических наукЛаптинская Т.
В.Îáùàÿ õàðàêòåðèñòèêà ðàáîòûÌèêðîñêîïè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ áèîìàêðîìîëåêóë áåëêîâ è íóêëåèíîâûõ êèñëîò ïðîâîäÿòñÿ, ãëàâíûì îáðàçîì, ìåòîäàìè ïðîñâå÷èâàþùåé ýëåêòðîííîé ìèêðîñêîïèè(ÏÝÌ) è ñêàíèðóþùåé çîíäîâîé ìèêðîñêîïèè (ÑÇÌ).  íàñòîÿùååâðåìÿ îáà ìåòîäà àêòèâíî ðàçâèâàþòñÿ, îïðåäåëÿþòñÿ íèøè ïðèìåíåíèÿ òîãî è äðóãîãî ýêñïåðèìåíòàëüíîãî ïîäõîäà.
Àòîìíî-ñèëîâàÿìèêðîñêîïèÿ (ÀÑÌ) ïðåèìóùåñòâåííî èñïîëüçóåòñÿ äëÿ èçó÷åíèÿïðîöåññîâ àäñîðáöèè âåùåñòâà íà ïîäëîæêè, íàïðèìåð äëÿ èññëåäîâàíèÿ àäñîðáöèè áåëêîâ, äëÿ ðàáîòû â æèäêèõ ñðåäàõ è ãàçàõ, äëÿèçó÷åíèÿ ìåõàíè÷åñêîé æåñòêîñòè áèîëîãè÷åñêèõ îáúåêòîâ è ïðîâåäåíèÿ ýêñïåðèìåíòîâ ïî ðàñòÿæåíèþ åäèíè÷íûõ ìîëåêóë ñèëîâîéñïåêòðîñêîïèè. Øèðîêèé ñïåêòð âîçìîæíîñòåé, ïðåäîñòàâëÿåìûõçîíäîâîé ìèêðîñêîïèåé äëÿ èçó÷åíèÿ áèîïîëèìåðîâ, îáóñëàâëèâàåòáîëüøîå êîëè÷åñòâî ðàáîò ïî ýòîé òåìàòèêå, ïóáëèêóåìûõ åæåãîäíîâ âåäóùèõ íàó÷íûõ æóðíàëàõ.Öåëü íàñòîÿùåé ðàáîòû ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêè äëÿ èññëåäîâàíèÿ ñ ïîìîùüþ ìåòîäà ÀÑÌ ñòðóêòóðû, ñâîéñòâ è îñîáåííîñòåé ïðîöåññà ôîðìèðîâàíèÿ áèîìàêðîìîëåêóëÿðíûõ êîìïëåêñîâíà ïðèìåðå äâóõ áèîëîãè÷åñêè çíà÷èìûõ ñèñòåì ñèñòåìû ñâåðòûâàíèÿ êðîâè è âèðóñíûõ ÷àñòèö.Ïåðâûé îáúåêò èññëåäîâàíèÿ áåëîê ôèáðèíîãåí, èãðàþùèéêëþ÷åâóþ ðîëü â ñâåðòûâàíèè êðîâè. Ïîä äåéñòâèåì òðîìáèíà îíïåðåõîäèò â àêòèâíóþ ôîðìó, íàçûâàåìóþ ôèáðèíîì, è àññîöèèðóåò, îáðàçóÿ êðóïíóþ ñåòü ìàêðîñêîïè÷åñêèõ âîëîêîí îñíîâóáóäóùåãî òðîìáà.
 íàñòîÿùåé ðàáîòå èññëåäîâàëàñü ìîëåêóëÿðíàÿñòðóêòóðà àññîöèàòîâ ôèáðèíà, îáðàçóþùèõñÿ íà ðàííèõ ñòàäèÿõðåàêöèè.Âòîðîé îáúåêò áåëîê îáîëî÷êè (ÁÎ) Õ âèðóñà êàðòîôåëÿ (ÕÂÊ).Èçâåñòíî, ÷òî â îïðåäåëåííûõ óñëîâèÿõ ÁÎ ÕÂÊ ìîæåò îáðàçîâûâàòü ñïèðàëüíî-ñèììåòðè÷íóþ îáîëî÷êó âîêðóã ÐÍÊ.
 íàñòîÿùåéÀêòóàëüíîñòü ðàáîòû.1ðàáîòå èññëåäîâàëèñü ñòðóêòóðà, ñâîéñòâà è óñëîâèÿ ôîðìèðîâàíèÿêîìïëåêñîâ, îáðàçîâàííûõ ÁÎ ÕÂÊ ñ ÄÍÊ.Îñíîâíîå ðàçëè÷èå ìåæäó ýòèìè ñèñòåìàìè ñîñòîèò â òîì, ÷òîàññîöèàòû ôèáðèíà ýòî ÷èñòî áåëêîâûå ñòðóêòóðû, â òî âðåìÿêàê âèðóñíûå ÷àñòèöû ñòàáèëèçèðóþòñÿ íóêëåèíîâîé êèñëîòîé èÿâëÿþòñÿ áîëåå ñëîæíûì íóêëåîïðîòåèäíûì êîìïëåêñîì.Äëÿ äîñòèæåíèÿ öåëè áûëè ïîñòàâëåíû ñëåäóþùèå çàäà÷è:1. Ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêè äëÿ âèçóàëèçàöèè àññîöèàòîâ ôèáðèíà íà ðàçíûõ ñòàäèÿõ ôîðìèðîâàíèÿ âîëîêîí è èññëåäîâàòüñòðóêòóðó ðàííèõ àññîöèàòîâ ôèáðèíà ìåòîäîì ÀÑÌ.2. Èññëåäîâàòü êîíôîðìàöèè ìîëåêóë ôèáðèíîãåíà, àäñîðáèðîâàííûõ íà ðàçëè÷íûå ïîäëîæêè ìåòîäàìè ÀÑÌ è ìîëåêóëÿðíîé äèíàìèêè (ÌÄ), ñîïîñòàâèòü ðåçóëüòàòû ìîäåëèðîâàíèÿñ ýêñïåðèìåíòàëüíûìè äàííûìè.3.
Èññëåäîâàòü óñëîâèÿ ôîðìèðîâàíèÿ è ñòðóêòóðó äåçîêñèðèáîíóêëåîïðîòåèäîâ (ÄÍÏ), ïîëó÷åííûõ in vitro íà îñíîâå ÁÎÕÂÊ è ÄÍÊ, ñðàâíèòü èõ ñòðóêòóðó ñ ðèáîíóêëåîïðîòåèäàìè(ÐÍÏ).4. Èññëåäîâàòü âîçìîæíîñòü ñîçäàíèÿ ÄÍÏ íà îñíîâå ÁÎ äðóãîãî ïîòåêñâèðóñà âèðóñà ìîçàèêè àëüòåðíàíòåðû (ÂÌÀëüò).5. Ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêó äëÿ àíàëèçà ìåõàíè÷åñêèõ ñâîéñòâ âèðóñíûõ ÷àñòèö ìåòîäîì ñèëîâîãî êàðòèðîâàíèÿ (ÑÊ).ÀÑÌ-èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè íà ìèêðîñêîïàõ Nanoscope 3a (Digital Instruments, ÑØÀ) è Multimode 5(VEECO, ÑØÀ) â ðåçîíàíñíîì ðåæèìå íà âîçäóõå è â áóôåðíûõðàñòâîðàõ. Ïðè èçìåðåíèÿõ íà âîçäóõå èñïîëüçîâàëè ñòàíäàðòíûåêðåìíèåâûå êàíòèëåâåðû fpN01 (ðåçîíàíñíàÿ ÷àñòîòà 118190 êÃö,æåñòêîñòü 5,3 Í/ì è ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëûÌàòåðèàëû è ìåòîäû.225 íì, NT-MDT, Ðîññèÿ) è îñòðûå êàíòèëåâåðû fpN01S (ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëû 10 íì, îñòàëüíûå ïàðàìåòðû òåæå).
Ïðè ñêàíèðîâàíèè â æèäêîñòè èñïîëüçîâàëè êàíòèëåâåðû SNL10 B (ðåçîíàíñíàÿ ÷àñòîòà 23 êÃö, æåñòêîñòü 0,12 Í/ì è ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëû ìåíåå 12 íì, VEECO, ÑØÀ) èDNP-10 D (ðåçîíàíñíàÿ ÷àñòîòà 18 êÃö, ñðåäíÿÿ æåñòêîñòü 0,06 Í/ìè ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëû 20 íì, VEECO, ÑØÀ).Äëÿ îáðàáîòêè äàííûõ èñïîëüçîâàëè ïðîãðàììó ÔåìòîÑêàí Îíëàéí (ÖÏÒ, Ðîññèÿ).Ðàáîòà ïî èññëåäîâàíèþ ïðîöåññà ôîðìèðîâàíèÿ ôèáðèíîâîé ñåòè áûëà ïðîâåäåíà ñîâìåñòíî ñ êàôåäðîé õèìèè ïðèðîäíûõ ñîåäèíåíèé õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ.
Èñïîëüçîâàëè ðåêîìáèíàíòíûé÷åëîâå÷åñêèé òðîìáèí ñî ñïåöèôè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ 3600 î.å./ìã(HTI, ÑØÀ), ÷åëîâå÷åñêèé òðîìáèí ñî ñòàíäàðòíîé àêòèâíîñòüþ110 î.å./ìë (NIBSC, Âåëèêîáðèòàíèÿ) è ÷åëîâå÷åñêèé ôèáðèíîãåí,âûäåëåííûé èç ïëàçìû êðîâè (Calbiochem, Ãåðìàíèÿ). Âñå ðåàêöèèïðîâîäèëè ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 27◦ C â áóôåðå, ñîñòîÿùåì èç20 ìM Òðèñ-àöåòàò, ðÍ 7,4, 0,14 Ì NaCl, 50 ìÌ KCl, 10 ìÌ MgCl2 ,10 ìÌ CaCl2 . Ïåðåä êàæäûì ýêñïåðèìåíòîì ïî ôîðìèðîâàíèþ ôèáðèíîâîé ñåòè îïðåäåëÿëè àêòèâíîñòü òðîìáèíà, ïîñêîëüêó ýòîò ôåðìåíò î÷åíü ÷óâñòâèòåëåí ê öèêëàì çàìîðîçêè-ðàçìîðîçêè è åãî àêòèâíîñòü ìîæåò ñïîíòàííî ïàäàòü. Äëÿ ìîäèôèêàöèè ïîâåðõíîñòèñëþäû è ñòåêëà ïðè ñêàíèðîâàíèè â æèäêîñòè èñïîëüçîâàëè ãåêñàìåòèëäèñèëàçàí (ÃÌÄÑ, Sigma-Aldrich, ÑØÀ).Ðàáîòà ïî ìîäåëèðîâàíèþ àäñîðáöèè ôèáðèíîãåíà ìåòîäîì ÌÄáûëà ïðîâåäåíà ñîâìåñòíî ñ êàôåäðîé áèîôèçèêè ôèçè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ.
Ìîäåëèðîâàíèå ñîðáöèè ïðîâîäèëè â ïðîãðàììåNAMD 2.7 áåñïëàòíîé ïðîãðàììå äëÿ ÌÄ, îáëàäàþùåé âûñîêîéýôôåêòèâíîñòüþ ðàñïàðàëëåëèâàíèÿ âû÷èñëåíèé è ÷àñòî ïðèìåíÿåìîé äëÿ ñèìóëÿöèè áîëüøèõ ñèñòåì, ñîñòîÿùèõ èç ìèëëèîíîâ àòîìîâ. Èñïîëüçîâàëè ñèëîâîå ïîëå CHARMM. Âñå âû÷èñëåíèÿ ïðîèç3âîäèëèñü íà ñóïåðêîìïüþòåðå Ëîìîíîñîâ, áûëè çàäåéñòâîâàíû 128âîñüìèÿäåðíûõ ïðîöåññîðîâ.Ðàáîòà ïî ðåêîíñòðóêöèè èñêóññòâåííûõ âèðóñíûõ ÷àñòèö áûëàïðîâåäåíà ñîâìåñòíî ñ êàôåäðîé âèðóñîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ.
Áûëè èñïîëüçîâàíû ÁÎ âèðóñîâ ÕÂÊ è ÂÌÀëüò,ÐÍÊ ÕÂÊ è âèðóñà òàáà÷íîé ìîçàèêè (ÂÒÌ), ÄÍÊ-êîïèÿ ÐÍÊÕÂÊ, âûäåëåííûå ïî ñòàíäàðòíûì ïðîòîêîëàì èç ñîîòâåòñòâóþùèõâèðóñíûõ ÷àñòèö.Íàó÷íàÿ íîâèçíà ðàáîòû.1. Ðàçðàáîòàíà ìåòîäèêà âèçóàëèçàöèè àññîöèàòîâ ôèáðèíà, îáðàçóþùèõñÿ íà íà÷àëüíîé ñòàäèè ñâåðòûâàíèÿ êðîâè. Âïåðâûåïîêàçàíî, ÷òî íàðÿäó ñ ïðîòîôèáðèëëàìè ñóùåñòâóþò áîëååòîíêèå àññîöèàòû ïðîôèáðèëëû, îáðàçîâàííûå ïðè ñâÿçûâàíèè α-Ñ äîìåíîâ ñîñåäíèõ ìîëåêóë äðóã ñ äðóãîì.2. Ïðîâåäåíî èññëåäîâàíèå ïðîöåññà ñîðáöèè ôèáðèíîãåíà íà ñëþäó è ñëþäó, ìîäèôèöèðîâàííóþ ÃÌÄÑ, ìåòîäàìè ÀÑÌ è ÌÄ.Ïîêàçàíî, ÷òî êîíôîðìàöèè ìîëåêóë íà ãèäðîôèëüíîé è ãèäðîôîáíîé ïîäëîæêàõ ñóùåñòâåííî ðàçëè÷àþòñÿ.3.
Ïîêàçàíà âîçìîæíîñòü ôîðìèðîâàíèÿ êîìïëåêñîâ ÁÎ ÕÂÊñ ÄÍÊ, ïîäîáðàíû îïòèìàëüíûå óñëîâèÿ äëÿ ôîðìèðîâàíèÿýòèõ ÍÏ. Ïîêàçàíî, ÷òî óêëàäêà áåëêà â ÄÍÏ ñóùåñòâåííîîòëè÷àåòñÿ îò ñòðóêòóðû îáîëî÷êè íàòèâíîãî âèðóñà è ÐÍÏ.Ïðåäïîëîæåíî, ÷òî ÁÎ ÕÂÊ ñâÿçûâàåòñÿ ñ ìàëîé áîðîçäêîéÄÍÊ.4. Ïîêàçàíî, ÷òî ïðè èñïîëüçîâàíèè ÁÎ äðóãîãî ïîòåêñâèðóñà ÂÌÀëüò ÄÍÏ íå îáðàçóþòñÿ. Âìåñòî ýòîãî ôîðìèðóþòñÿäëèííûå òÿæè àññîöèàòû ÁÎ, íå ñîäåðæàùèå ÄÍÊ.5. Ðàçðàáîòàíà ìåòîäèêà äëÿ àíàëèçà ìåõàíè÷åñêèõ ñâîéñòâ âèðóñíûõ ÷àñòèö ìåòîäîì ÑÊ.4Ðåçóëüòàòû äèññåðòàöèèíîñÿò â ïåðâóþ î÷åðåäü ôóíäàìåíòàëüíûé õàðàêòåð.
Ïî ìíåíèþ àâòîðà, íàèáîëåå èíòåðåñíû òðè ðåçóëüòàòà: îáíàðóæåíèå òîíêèõ àññîöèàòîâ ôèáðèíà, â êîòîðûõ ìîëåêóëû áåëêà ñâÿçàííû, ïðåäïîëîæèòåëüíî, çà ñ÷åò âçàèìîäåéñòâèÿ α-C äîìåíîâ ñîñåäíèõ ìîëåêóë,îïðåäåëåíèå îñîáåííîñòåé ñòðóêòóðû ÄÍÏ è îïðåäåëåíèå æåñòêîñòè âèðóñíûõ ÷àñòèö ìåòîäîì ÑÊ.Âàæíûì ìåòîäîëîãè÷åñêèì ðåçóëüòàòîì äèññåðòàöèè ÿâëÿåòñÿðàçðàáîòàííûé àëãîðèòì äëÿ àíàëèçà äàííûõ ÑÊ. Ñèëîâîå êàðòèðîâàíèå âåñüìà òðóäîåìêèé ýêñïåðèìåíòàëüíûé ìåòîä, òðåáóþùèéñëîæíîãî àíàëèçà è èìåþùèé ñåðüåçíûå àðòåôàêòû, êîòîðûå ÷àñòîíå ó÷èòûâàþòñÿ ïðè îáðàáîòêå.
Íàñòîÿùàÿ ðàáîòà âíîñèò âêëàä âðàçâèòèå ýòîãî ìåòîäà.Àïðîáàöèÿ ðàáîòû. Îñíîâíûå ðåçóëüòàòû äèññåðòàöèîííîé ðàáîòû äîêëàäûâàëèñü íà ñëåäóþùèõ íàó÷íûõ êîíôåðåíöèÿõ è øêîëàõ: 2nd International School on Surface Science ¾Technologies andMeasurements on Atomic Scale¿ 2012, Sochi, Russia; Øåñòàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2012, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; Õ ÷òåíèÿ ïàìÿòè àêàäåìèêà Þ.À. Îâ÷èííèêîâà 2011, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; 17th International Biophysics Congress 2011, Beijing, China; 2nd International School ¾Nanomaterials andNanotechnologies in Living Systems. Safety and Nanomedicine¿ 2011,Moscow region, Russia; Ïÿòàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2011, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; XXIIIçèìíÿÿ ìîëîäåæíàÿ íàó÷íàÿ øêîëà ¾Ïåðñïåêòèâíûå íàïðàâëåíèÿôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè è áèîòåõíîëîãèè¿ 2011, Ìîñêâà,Ðîññèÿ; ESF-EMBO Research Conference ¾Molecular Perspectives onProtein-Protein Interactions¿ 2010, Sant Feliu de Guixols, Spain;20th Anniversary Korea-Russia Science and Technology Forum 2010,Ìîñêâà, Ðîññèÿ; ×åòâåðòàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2010, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; ÒðåÏðàêòè÷åñêàÿ çíà÷èìîñòü ðàáîòû.5òüÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2009, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; Ïåðâàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ íàó÷íàÿ øêîëà ¾Íàíîìàòåðèàëû è íàíîòåõíîëîãèè â æèâûõ ñèñòåìàõ¿ 2009, Ðîññèÿ.Ëè÷íûé âêëàä àâòîðà.
