Структурные и функциональные характеристики природных и хирально модифицированных модельных ионных каналов, страница 6

В табл. 1 представлены значения+ионных токов при различных значениях n .Таблица 1Ионные токи ( J X ) при различных значениях отношений ( n ) диаметров открытого и конформационно модифицированного потенциал-зависимого калиевого α/βканала1.01.11.21.31.41.51.61.71.8n0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.001J Li , пА+J Na , пА0.081 0.072 0.063 0.054 0.045 0.036 0.027 0.017 0.012J K , пА1.030 0.810 0.690 0.570 0.450 0.330 0.210 0.090 0.076++Для объяснения причин падения калиевого тока практически до значений,соизмеримых с натриевым током канала, обратимся к профилям свободнойэнергииканала,представленных, каки в случае открытого канала, для трехпоследовательныхинтервалов изменения координаты осиZ: области селективного фильтра и центральной полости αсубъединицы(рис.14A), области ниж-Рис.

15. ВАХ закрытого α/β-каналаней поры α-субъединицы и поры β-субъединицы (рис. 14Б).Существенное различие G iwc = G iwc (Z ) открытого и закрытого канала наблюдается только в области сужения поры β-субъединицы. При этом высотыбарьеров для различных ионов находятся в следующей последовательностиK+<Na+<Li+. Появление столь высоких энергетических барьеров в закрытом канале связано не с увеличением энергии взаимодействия в системе ион-канал, а сувеличением энергии взаимодействия в системе ион-вода в результате стерических ограничений ион-водного комплекса. Действительно, увеличение стерических ограничений для ион-водного комплекса приводит к уменьшению количества молекул воды в частично дегидратированном комплексе и увеличениюэнергии ион-водного комплекса.Результаты расчета ВАХ закрытого потенциал-зависимого калиевого α/βканалавусловияхсимметричныхмонокатионныхрастворов( [I]L = [I]R = 0.04 М) представлены на рис. 15.

Данная связь показывает существование линейной зависимости между током и напряжением на участке 0–60 мВс малыми величинами проводимости одиночного канала: для K+ 1.27 пСм, дляNa+ 0.20 пСм, для Li+ 0.016 пСм, для Rb+ 1.05 пСм, для Cs+ 0.005 пСм, что соответствует закрытому состоянию потенциал-зависимого калиевого канала.Таким образом, переход потенциал-зависимого калиевого α/β-канала изоткрытого в закрытое состояние осуществляется при связывании молекулы субстрата с β-субъединицей канала, сопровождающийся конформационной перестройкой канала при изменении разности потенциалов на концах мембраны.В результате предложенная и теоретически обоснованная нами модельнаяструктура α/β-канала хорошо согласуется с экспериментально наблюдаемойструктурой гомологичного канала Kv 1.2.Подобный подход мы использовали и для исследования потенциалзависимого калиевого канала Kv1.2 типа Shaker из Rattus norvegicus, для которого получили хорошее согласие экспериментальных и расчетных функциональных характеристик.В третьей главе проведено исследование структуры и функциональныххарактеристик хирально модифицированных модельных каналов с инвариантнойи модифицированной природной аминокислотной последовательностью.Долгое время считалось, что хиральная чистота биосферы носит абсолютный характер, т.е.

биологически важные реакции в живых организмах происходят только с участием L-аминокислот и D-сахаров.Однако хиральные антиподы природных органических соединений играютсущественную роль в биохимии и физиологии всех организмов – от бактерий домлекопитающих. Например, D-Ser является нейромодулятором, связывающимсяс центром связывания NMDA-рецептора нервных клеток млекопитающих. Компоненты клеточной стенки бактерий зачастую содержат L-углеводы и остатки Dаминокислот. Данные остатки также содержат некоторые пептидные антибиотики. В нервных клетках высших организмов находят D-Ala, D-Asp и D-Ser, в некоторых случаях в значительных концентрациях.

Однако все, что относится крибосомальному синтезу полипептидов, характеризуется абсолютной хиральнойчистотой: полипептиды содержат остатки только L-аминокислот, а нуклеиновыекислоты – только D-сахара.Вопрос о биологической роли гомохиральности этих важнейших биополимеров относительно прост.

Так, гомохиральность белков и нуклеиновых кислот определяет их стереоспецифичность – необходимое условие матричногосинтеза, а также обусловливает стабильность их структур, обеспечивающих ихфункционирование. Но, несмотря на значительные успехи, достигнутые в этойобласти, биологические основы того, что белки-ферменты и нуклеиновые кислоты имеют строго определенный знак хиральности, остаются неизвестными.Нам представляется, что ответ на последний вопрос необходимо искать, вчастности, в исследовании влияния (L→D)-преобразования аминокислотных остатков на структурные и функциональные характеристики ионных каналов.Возможны два способа построения пространственной структуры каналовиз D-аминокислот.1. Построение модельного канала полным зеркальным отражением природного канала.

В этом случае получаем канал из D-аминокислот с преобразованием торсионных углов всех аминокислот вида φ→-φ и ψ→-ψ. Следствием этогобудет, например, преобразование всех правых α-спиралей в левые. Не вызываетсомнений, что «отраженный» канал ни чем, кроме направления вращения αспиралей и направления скрученности β-структур из-за скрученности отдельныхβ-тяжей, не будет отличаться от природного. Неизменной будет и потенциальнаяэнергия молекулы канала и его функциональные характеристики. Поэтому по-строение и исследование функционирования таких хирально модифицированных каналов не представляет интереса.2. Построение модельного канала заменой всех L-аминокислот на Dаминокислоты при сохранении природной вторичной структуры канала. Такаязамена эквивалентна замене бокового радикала R на H-атом, стоящий при αуглероде аминокислоты.

В результате, при сохранении природной вторичнойструктуры в молекуле модельного канала появляются значительные стерическиенапряжения, снятие которых приведет к изменению его третичной и четвертичной структуры, а также функциональных характеристик. Поэтому хирально модифицированные каналы, полученные по данной схеме, представляют наибольший интерес в исследовании их структуры и функциональных характеристик.Следует отметить, что появление стерических напряжений является вполнеобоснованным, т.к. углы φ и ψ модифицированных аминокислот в основном попадают в запрещенные области карты Рамачандрана.Стерические напряжения в канале после замены L-аминокислот на Dаминокислоты снимали методами молекулярной динамики в интервале 10 пс пришаге 0.001 пс.

При расчете функции потенциальной энергии молекулы мы использовали представление и параметризацию силового поля AMBER. Данныйвыбор обоснован тем, что силовое поле AMBER было параметризовано для исследования структуры и динамики белков и нуклеиновых кислот. Для исследования функциональных характеристик хирально модифицированных модельныхканалов использовали подход, применявшийся нами для исследования природных калиевых каналов.D-аминокислотные ионные каналы с инвариантной первичной структурой.Результаты численного моделирования молекулярной динамики каналовпоказывают, что зависимости потенциальной энергии молекулы канала от времени характеризуются наличием множества локальных минимумов, причем понашим наблюдениям, каждый из них соответствует пору-формирующей конформации молекулы как природного, так и хирально модифицированного канала.В табл.

2 представлены результаты исследований структуры и функциональных характеристик хирально модифицированных модельных каналов: отношение наиболее глубокого локального минимума природного канала к соот-ветствующему минимуму его хирально модифицированного изомера ( U L D ), отношение среднего радиуса поры D-аминокислотного канала (D-канала) к радиусу поры его природного аналога ( R D L ), ионные проводимости ( g I ) и токи ( J I )D-канала при φ=60мВ.Таблица 2Структурные и функциональные характеристики D-аминокислотных каналов синвариантной первичной структуройКаналUL DRD Lg I , пСм+D-KcsA0.991.4D-KvAPo1.011.2D-KvAPc1.011.2D-α/βo1.0121.05D-α/βc1.0111.05D-Kv1.2o1.0011.07D-Kv1.2c1.0021.07LiNa+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+18.533146.366459.700401.8833.8503.68331.267405.305318.9003.4830.2160.86612.8505.7660.7162.7177.200174.267164.0832.5330.3832.60013.90012.8000.1502.7175.66799.78379.0831.5832.7175.66799.78379.0831.583J I , пА+LiNa+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+Li+Na+K+Rb+Cs+0.0150.1031.5801.1650.0020.2211.87624.32119.1340.2090.0130.0520.7710.3460.0430.1630.43210.4569.8450.1520.0230.1560.8340.7680.0090.1010.3405.9874.7450.0950.0910.0950.0970.0880.076Представленные в табл.

2 теоретические результаты наглядно демонстрируют, что полная потенциальная энергия хирально модифицированных и соот-ветствующих природных каналов совпадает, а изомеризация аминокислот каналов приводит к увеличению радиуса поры. Кроме того, хирально модифицированный изомер канала KcsA не является калий-избирательным с большими значениями ионных токов, что характерно и для открытых D-каналов KvAP, α/β иKv1.2. Хирально модифицированные изомеры закрытых каналов KvAP, α/β иKv1.2 обладают проводимостями и токами, практически совпадающими с таковыми для их природных изомеров.

Этот результат позволяет считать, что хирально модифицированные изомеры закрытых потенциал-зависимых каналов насамом деле является не закрытыми, а открытыми потенциал-зависимыми калиевыми каналами.Подобные же исследования нами проведены для NR1-центра связыванияNMDA-рецептора в комплексе с Gly, D-Ser и D-cSer. В результате численногомоделирования молекулярной динамики было установлено, что комплекс природного NR1-центра связывания NMDA-рецептора и природных D-лигандовэнергетически более стабилен, чем комплекс природного NR1-центра связывания NMDA-рецептора и неприродных L-лигандов.