Автореферат (Разработка методик хроматомасс-спектрометрического определения наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов в биообъектах), страница 4

9).18А.Б.В.Д.Г.Е.Рисунок 8. Зависимость степени извлечения целевых аналитов от концентрации щелочи (А, Б),температуры (В, Г) и времени (Д, Е) гидролиза19Рисунок 9. Зависимость степени извлечения ТГКК от соотношениягексан:этилацетатНа основании анализа результатов проведенных экспериментовоптимизирован подход к пробоподготовке волос для анализа в них«природных» каннабиноидов и разработана высокочувствительная методикаанализа природных каннабиноидов в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС [19].Проведение валидации (табл. 7) полученной методики показало, что ееуровень ПД удовлетворяет требованиям SOHT к пределам обнаруженияканнабиноидов в волосах.Таблица 7.

Метрологические характеристики разработанной методики(Р=0,95, N=10)Название веществаТГККВведено, С ,0пг/мг10,0Найдено,С+ΔС, пг/мгSS8,9±1,11,330,15rАнализ синтетических каннабиноидов в волосах – новое иперспективное направление ХТА, по которому исследования находятся наначальной стадии и публикации немногочисленны.Для анализа «синтетических» каннабиноидов в волосах выбран методГХ-МС/МС, так как в литературе информация по применению данногометода для анализа волос не представлена. Применение ГХ, исходя изструктуры синтетических каннабиноидов, весьма актуально, т.к. не требуютдериватизации. Детектирование проводили в режиме мониторингамножественных реакций (MRM).

В результате исследования условийдетектирования каннабимиметиков не только определены наиболеехарактеристические MRM переходы для каждого соединения (табл. 8), но исделано предположение о природе их дочерних ионов.Таблица 8. Условия детектирования синтетических каннабиноидовметодом ГХ-МС/МС№ сегментаНачальноевремясканирования, минНазваниевеществаВремяудерживаниевещества, мин112.00UR-144F12.9120MRMпереходыЭнергиясоударения,эВ304→233304→213304→1452020302AB-PINACA-F13.32AB-PINACA14.1813.00316.00ABCHMINACA17.72418.05ABFUBINACA18.13THJ-220118.70518.60AM-220118.83AM-223323.986723.00JWH-21024.06PB-2224.22NM-220124.7324.60825.00PB-22F25.10925.90AM-122026.061026.50QCBL-BZ-F27.52304→233304→213304→145330→215330→145312→241312→145312→117324→253324→145324→109360→285360→271360→215360→284360→270360→342458→400458→260369→341369→312369→270369→195358→214358→144358→116375→232375→144375→116376→232376→144376→116382→324382→184382→227396→252396→1092020302030203040203030202040202020204040204040204040202030При сравнении масс-спектров и предложенных ионных реакцийустановлено, что для каждой группы синтетических каннабиноидовсуществует один общий фрагментарный ион.

Для индазол-3-карбоксамидов− с m/z = 145, а 3-нафтоилиндолов − m/z = 270. Исходя из этого, для каждойгруппы синтетических каннабиноидов можно выделить характеристическийдиагностический ион и с помощью режима «Product ion scan» проводитьскрининговый поиск данных фрагментов на хроматограммах пробпредположительно содержащих неизвестные аналоги каннабимиметиков.Для пробоподготовки волос использовали методику, разработаннуюдля природных каннабиноидов, при этом степени извлечения AB-PINACA,AB-Chminaca, NM-2201, JWH-210 и AM-2201 находились в пределах 5065% (см.

рис. 10).21Рисунок 10. Эффективность извлечения синтетических каннабимиметиковиз волосОбщая продолжительность анализа внутренней области волос поразработанной методике химической идентификации синтетическихканнабиноидов различных классов в волосах методом ГХ-МС/МС [20]составляет 2,5 часа, что делает ее весьма экспрессной.

ПД по даннымсоединениям не представлены в рекомендациях SOHT. Результаты валидацииметодики представлены в таблице 9.Таблица 9. Метрологические характеристики разработанной методики(Р=0,95, N=10)Название веществаВведено,С , пг/мгНайдено,С+ΔС, пг/мгSS10,010,025,020,010,5±1,19,8±0,823,2±2,918,1±1,81,601,253,952,760,150,130,170,150AB-PinacaAB-ChminacaAM-2201JWH-210rВсе разработанные методики анализа волос рассмотрены на НТС,утверждены руководством Института криминалистики Центра специальнойтехники ФСБ России и успешно применяются в практической деятельностиИнститута. С помощью них проанализировано более трехсот образцов волос иполученные результаты использованы в ходе экспертной деятельности.Пятая глава посвящена разработкам высокочувствительныхметодик анализа целевых веществ в биожидкостях.В связи с тем, что анализ волос информативен только в случаемногократного употребления ФАВ, альтернативными биообъектами,позволяющими обнаружить экзогенные вещества в организме человека,являются моча и кровь.

Существует много методик анализа веществ в данныхбиобъектах, выбраны наименее охваченные области.Разработкаметодикихимико-токсикологическогоопределенияамфетамина в крови методом ВЭЖХ-МС/МС. В ходе работы проведеносравнение эффективности методов выделения веществ из матрицы крови.Первый метод представлял собой твердофазную экстракцию на сорбенте С18.Второй метод – кислотный гидролиз с последующей жидкость-жидкостнойэкстракцией смесью растворителей хлороформ : изопропанол (9:1).

Третий22метод сочетал жидкостную и дисперсионную твердофазную экстракции (методQuechers). Для этого использованы модельные образцы крови, полученныепутем добавления 5 мкл стандартного метанольного раствора амфетамина сконцентрацией 10 мкг/мл к 1 мл цельной бланковой крови.В результате твердофазной экстракции на сорбенте С18 степеньизвлечения амфетамина (αамф) составила 34%, кислотного гидролиза споследующей ЖЖЭ – 67 %, а методом Quechers – 72 % (см. рис. 11). Стольнизкая αамф в случае ТФЭ может быть связана либо с «проскоком» целевоговещества на этапе промывки, либо со сложностью сорбции амфетамина накратридже, вызванной связыванием вещества с липидами матрицы.Применение метода Quechers по сравнению с кислотным гидролизом не толькодает более высокую степень извлечения амфетамина из крови, но и позволяетсущественно сократить время подготовки проб к инструментальному анализу.Рисунок 11.

Диаграмма степени извлечения амфетамина из матрицыкрови по трем методикам.Инструментальный анализ проводили методом ВЭЖХ-МС/МС, для чегоэкспериментально подобраны условия SRM сканирования и эффективногоразделения амфетамина и компонентов матрицы крови.С целью проведения метрологического контроля полученной методикибыли определены следующие параметры:- линейный диапазон калибровочной кривой – от 10 до 250 нг/мл (см.рис. 10);- предел детектирования – 10 нг/мл (см. рис.

12).Рисунок 12. Калибровочная кривая содержания амфетамина в крови.23Обнаружение морфина и кодеина в моче. Поиск способов отличияупотребления морфина и кодеинсодержащих препаратов. В экспертнойпрактике нередко возникает задача отличить употребление лекарственныхпрепаратов, содержащих кодеин, и прием опиатов (морфина) по результатамхимико-токсикологического анализа мочи. В ходе исследований определенынедостатки применения метода ГХ-МС для определения морфина и кодеина вмоче.

Поэтому разработана высокочувствительная методика определенияморфина, кодеина и норкодеина в моче методом ВЭЖХ-МС/МС.Экспериментально определены параметры SRM детектирования целевыханалитов и условия их хроматографического отделения от матрицы мочи.С помощью этих методик проведен анализ серии образцов проб мочилюдей, употреблявших морфин и кодеин (более 100 образцов) и определеныкритерии дифференцирования отличия употребления кодеина и опиатов порезультатам анализа мочи. Дополнительно исследована возможность процессаперехода кодеина в морфин и обратно в биологической матрице мочи сразличным значением рН при моделировании хранения образцов в условияхпониженной температуры (− 4°С).В результате проведенных исследований на хроматограммах проб сморфином для всех значений рН пиков кодеина обнаружено не было.Аналогичная ситуация наблюдалась и для проб с кодеином.

Следовательно,при хранении проб мочи в холодильнике взаимопревращения морфина икодеина не происходит ни при каких значениях рН.На основании проведенных исследований определены следующиепоказатели употребления кодеинсодержащих препаратов:1.

Отношение концентраций общего морфина и общего кодеина в моченаходится в диапазоне 0,02-4,0.2. Концентрация морфина в моче не превышает 800 нг/мл.3. В пробе детектируется норкодеин, причем его содержание сравнимо сконцентрацией кодеина.Определение ТГК-кислоты в моче с использованием методаВЭЖХ-МС/МС. Одной из актуальных задач ХТА является обнаружениеметаболита природных каннабиноидов – ТГКК в моче. В настоящее время дляэтого применяется ГХ-МС, основными недостатками которого являютсясложная дериватизация проб и низкая чувствительность. Поэтому разработанаи отвалидирована методика химико-токсикологического определения ТГКК вмоче методом ВЭЖХ-МС/МС [18].Условия гидролиза мочи, применяемогов качестве пробоподготокви дляразрушения глюкуронидов ТГК-кислоты значительно отличаются, поэтому наданном этапе было важно выбрать наиболее оптимальную температуругидролиза и концентрацию щелочи.

Диапазон температур гидролизаварьируется от комнатной температуры (20-25°С) до 60°С, а концентрациящелочи (KOH или NaOH) от 1N до 10N.24В результате проведенного исследования оказалось, что наибольшаяплощадь пика ТГК-кислоты получается при выдерживании пробы в течение20 минут при температуре 60˚С с добавление 5N KOH.Для выделения ТГК-кислоты из пробы мочи после гидролиза используютжидкость-жидкостную или твердофазную экстракцию при значениях рН средыот 2 до 5. Наиболее распространенным экстрагентом для ЖЖЭ данноговещества является смесь гексана с этилацетатом в различных соотношениях.Для ТФЭ используются картриджи С18 Ser-Pac или их аналоги. Отметим, чтометод жидкость-жидкостной экстракции является более дешевым и простым висполнении.

Поэтому проведен эксперимент по определению наиболееэффективного соотношения гексан:этилацетата. Анализ хроматограмм показал,что наиболее оптимальным является соотношение растворителей 5:1, т.к. сувеличением количества этилацетата в смеси увеличивается количествомешающих компонентов матрицы, а с его понижением уменьшаетсяколичество выделяемой ТГК-кислоты.Предел обнаружения данной методики составил 1 нг/мл.В результате апробации данной методики проанализировано свыше100 образцов мочи добровольцев. На рисунке 13 представлена хроматограммаположительного образца мочи, полученного в процессе апробации.Рисунок 13.