Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 21

При тестировании образцов сыворотки крови отмечено, чтовременное окно детектирования при назальном способе приема пептидов шире,чем при внутривенном введении.Таким образом, в эксперименте с участием бо̀льшего числа волонтеровпоказано влияние индивидуальных особенностей организма волонтеров и способавведения на метаболизм пептидов.

В частности, влияние метаболическихособенностей волонтеров отчетливо видно по различиям профилей измененийконцентраций GHRP-2 и его метаболита GHRP-2 (1-3) ОН в образцах мочи послеприема 100 мкг пралморелина дигидрохлорида и в образцах сыворотки крови приидентификации следовых количеств метаболита GHRP-2 (1-3) ОН в пробах двухдобровольцев (волонтер 8 и волонтер II). Из представленных данных очевидно,123что при внутривенном введении концентрация препарата выше по сравнению сназальным введением, несмотря на разницу дозировки в 5 раз.

Таким образом,опираясь на полученные данные, можно предположитьо возможностиустановления способа введения препарата по общему количеству и соотношениюконцентраций GHRP-2 и GHRP-2 (1-3) ОН, циркулирующих в кровеносном русле.В то же время стоит отметить, что пиковые концентрации GHRP-2 в образцахсыворотки крови волонтеров 3 и 4 после внутривенного введения препарата лишьв 2–2.5 раза превышают значения пиковых концентраций в образцах сывороткикрови волонтеров I и II после назального приема.

Поэтому данное предположениетребует подтверждения экспериментами с участием большего количестваволонтеров для приема препаратов назальным способом.Также, при анализе образца мочи волонтера 8 после приема 100 мкгпралморелинадигидрохлоридадетектированметаболитGHRP-2 (1-3) ОН,концентрация которого в 3 раза превосходила концентрацию исходного пептидаGHRP-2.Вданномслучаеопределениеметаболитаимеетбо̀льшуюдиагностическую ценность: временное окно детектирования GHRP-2 (1-3) ОНсоставило более 10 ч по сравнению с исходным пептидом (не более 4 ч).

Данныйслучай дополнительно подтвердил необходимость включения метаболитовнизкомолекулярных пептидных соединений в скрининговую методику с цельюповышения ее эффективности.Таким образом, анализ образцов мочи и сыворотки крови после приемапрепаратов GHRP-2 и GHRP-6 внутривенным и назальным способами подтвердилвлияние метаболических особенностей и/или различных способов введения, чтодолжно учитываться при разработке антидопинговых методик путем включениякак можно большего числа возможных диагностически ценных метаболитов.124ЗаключениеПрисравненииснизкомолекулярнымидопинговымисубстанциямипрепараты белковой природы обладают рядом преимуществ, например, слабаяиммуногенность и низкая токсичность образующихся метаболитов.

Такимисоединениями,набирающимипопулярностьсредипрофессиональныхспортсменов и спортсменов-любителей, являются соединения класса GHRP.Однако быстрая деградация отрицательно сказывается на эффективности ипродолжительности действия препаратов пептидной природы, поэтому многиеработы посвящены различным подходам увеличения их стабильности, некоторыеих которых были использованы при разработке GHRP. Тем не менее, как всебелки и пептиды, GHRP характеризуются быстрой деградацией в организмечеловека, что делает их еще более привлекательными допинговыми соединениямии ставит перед антидопинговыми лабораториями задачу по разработкевысокочувствительных методов их идентификации в биожидкостях спортсменов.Применяемые на сегодняшний день методики обнаружения различныхдопинговых субстанций предполагают детектирование не только исходныхсоединений, но и их метаболитов и/или маркеров.

На первом этапе настоящейработы проведен анализ литературных источников по основным используемымподходам увеличения стабильности пептидов и их влиянии на метаболизмсоединений (часть 1.2). На основе изученных данных выявлены потенциальныенаправления биотрансформации: гидролиз полипептидной цепи, особенно попептидным связям, незащищенных синтетическими или D-аминокислотами, идезамидирование.

Обобщение литературных данных по основным методамизученияметаболизмасоединенийпептиднойприродыпоказало,чтохроматомасс-спектрометрические методы являются наиболее перспективными инадежными для идентификации образующихся метаболитов (часть 1.3). Взаключительной части обзора литературных данных приведено описаниеспособов определения GHRP в образцах сыворотки крови и мочи, применяемых вразличных антидопинговых лабораториях (часть 1.4).125В части 3.1 работы представлены результаты по изучению метаболизмаизвестных GHRP с использованием подходов in vitro и in vivo для полученияинформации о наиболее диагностически ценных метаболитах.

В качествемодельныхсистемin vitroиспользоваликоммерческидоступныепротеолитические ферменты, сыворотку крови человека и субклеточные фракциипечени и почек человека. Идентификацию метаболитов соединений, полученныхв условиях in vivo в моче проводили после однократного назального приема пятинаиболее известных представителей данного класса: GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6,гексарелина и ипаморелина. Выявлены наиболее долгоживущие и диагностическиценные метаболиты пептидов.

По результатам сравнения наборов полученныхметаболитов in vitro и in vivo, почечная микросомальная фракция и S9 фракцияпечени человека признаны наиболее эффективными моделями in vitro длямоделирования метаболических процессов. Полученные данные легли в основуспособа определения метаболитов GHRP в биологических жидкостях человека идополнили антидопинговую методику определения GHRP в образцах мочичеловека методом СВЭЖХ-МС/МС.

Для быстрого и эффективного анализа пробмочи спортсменов предложено четыре различных протокола пробоподготовки.Замена ручного доведения рН разбавлением образцов мочи буферным растворомпозволяет значительно упростить процесс пробоподготовки и сократить времяанализа, тем самым повысить производительность методики. Использованиепланшетов для микроэлюции вместо картриджей для ТФЭ сокращает времяпробоподготовки и расход реагентов (часть 3.2). В ходе апробации предложеннойметодики определены времена детектирования пяти GHRP и их метаболитовпосле назального приема и показано влияние индивидуальных метаболическихособенностей волонтеров и способов приема на метаболизм пептидовприанализе образцов мочи и сыворотки крови после однократного назального ивнутривенного введения GHRP-2 и назального способа приема GHRP-6(часть 3.3).Предложенный способ определения метаболитов GHRP в биожидкостяхчеловекадополнилранееразработанную126методикуопределениянизкомолекулярных соединений пептидной природы в целях антидопинговогоконтроля.

Опыт успешного применения методики позволил специалистам ФГБУАДЦвыявитьслучаизлоупотребленияспортсменами.127соединениямиданногоклассаВыводы1. Выделены и идентифицированы 25, 23, 61 и 58 метаболитов для 8соединенийклассаGHRPврезультатеинкубацииссывороткойчеловеческой крови, микросомальными фракциями печени и почекчеловека, S9 фракцией человеческой печени, соответственно.2.

Установлено, что человеческие почечная микросомальная и печеночная S9фракции представляют собой наиболее эффективные in vitro модели дляизучения процессов биотрансформации соединений пептидной природы ворганизме человека. Помимо гидролиза пептидных связей основнымнаправлением метаболизма является замена NH2-группы на ОН-группу приС-концевом аминокислотном остатке при дезамидировании.3. Идентифицированы 17 метаболитов in vivo для 5 наиболее популярныхсоединений класса GHRP, 16 из них – впервые в моче человека.Идентифицирован не описанный ранее метаболит GHRP-1 (2–4) ОН вобразцах мочи после однократного назального приема пептида. Данныйметаболит характеризуется наибольшим временным окном детектирования(до 27 ч) и признан наиболее диагностически ценным среди остальныхметаболитовGHRP-1.Мониторингэтогоидругихметаболитовпредставляет единственный способ выявить факт приема GHRP-1 в видуполной деградации исходного соединения.4.

Диагностически ценными признаны 8 из 17 детектируемых метаболитовin vivo и включены в разработанный способ определения метаболитовGHRP в моче человека методом СВЭЖХ-МС/МС.5. Разработана методика определения GHRP и их метаболитов в образцахмочи человека методом СВЭЖХ-МС/МС.6. Предложены четыре протокола условий выделения GHRP и их метаболитовиз мочи человека методом ТФЭ, что значительно повысило экспрессностьанализа и снизило время пробоподготовки образцов и расход реактивов.1287. ПредложеннаяметодикакачественногоопределенияGHRPиихметаболитов в моче человека методом СВЭЖХ-МС/МС валидирована всоответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025.8.

При апробации методики оценены временные окна детектирования пятиGHRP и их метаболитов в моче после приема пептидов, показано влияниеиндивидуальных метаболических особенностей волонтеров и способовприеманапроцессыбиотрансформациисоединений,подтвержденопреимущество мочи перед сывороткой крови в качестве объекта анализа.9. Применение предложенного способа определения GHRP и их метаболитов вмоче человека позволило специалистам ФГБУ АДЦ выявить случаизлоупотребления соединениями данного класса спортсменами.129БлагодарностиЯ благодарю моего научного руководителя Кротова Григория Ивановича зазнания и навыки, которые получила при работе в лаборатории, за подробныеконсультации по работе.

Выражаю искреннюю благодарность моему научномуруководителю Ефимовой Юлии Александровне за интерес к работе, полезныесоветы по структуре и ее содержанию.Я благодарю старшего научногосотрудника ФГБУ АДЦ Екатерину Николаевну Обухову за знания по массспектрометрии, и рабочий энтузиазм, которые я получила в процессе совместнойработы, за профессиональную и дружескую поддержку на всех этапах работы.ВыражаюискреннююпризнательностьДиректоруФГБУАДЦМаринеАлександровне Дикунец за содействие в выполнении работы, ценные замечания исоветы по содержанию и оформлению работы.Благодарю всех сотрудниковФГБУ АДЦ за доброжелательность и за прекрасную рабочую атмосферу.130Список условных обозначений и сокращенийАДГ – антидиуретический гормон;АКТГ – адренокортикотропный гормон;ВАДА – Всемирное антидопинговое агентство;ВИП – вазоактивный интестинальный пептид;ВС – внутренний стандарт;ГПП-1 – глюкагоноподобный пептид-1 (от англ.

GLP-1 - Glucagon-likepeptide-1);ГР – гормон роста;ДАГ – диацилглицерин;ДПП4 – дипептидилпептидаза-4 (от англ. DPP IV - Dipeptidyl peptidase IV);ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;ЖКТ – желудочно-кишечный тракт;ЖХ – жидкостная хроматография;ИФА – иммуноферментный анализ;ИФР-1 – инсулиноподобный фактор роста-1;ИФР-2 – инсулиноподобный фактор роста-2;ИФР-СБ-3 – ИФР-связывающий белок -3;МС – масс-спектрометрия;МСВР – масс-спектрометрия высокого разрешения;НАДФ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат;наноВЭЖХ–нанопотоковаявысокоэффективнаяжидкостнаяхроматография;Р (на стр. 29) – метаболит вазопрессина, мощный кортикотропин-рилизингпептид (от англ., pressinoic acid);Р – субстрат;РИА – радиоиммунный анализ;СВЭЖХ–сверхпроизводительнаяхроматография;СРА – карбоксипептидаза А;131высокоэффективнаяжидкостнаяСРВ – карбоксипептидаза В;ТВ-500 – торговое название N-концевого ацилированного фрагмента (17-23)тимозина β4;ТФЭ – твердофазная экстракция;ФИА – флуороиммунологический анализ;ФСБ – фосфатно-солевой буфер;ХИАД – химическая ионизация при атмосферном давлении;цАМФ – циклический аденозинмонофосфат;ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота;ЭРИ – электрораспылительная ионизация;ЯМР – ядерный магнитный резонанс;ACE – ангиотензин-конвертирующий фермент (от англ.

ACE - Angiotensinconverting enzyme);Aib – 2-аминоизомасляная кислота;ALS – кислотно-лабильная субъединица (от англ. acid-labile subunit);AVP – антидиуретический гормон (от англ. arginine vasopressin);DDAVP – десмопрессин (от англ. 1-desamino-8-D-arginine vasopressin);DesgAVP – дезаминглицин вазопрессин (от англ. desglycinamide AVP);DPP IV – дипептидилпептидаза-4, ДПП4 (от англ. Dipeptidyl peptidase IV);D-β-Nal – D-β-нафтилаланин;EGF – эпидермальный фактор роста (от англ.Epidermal Growth Factor);FDA – Управление по санитарному надзору за качеством пищевыхпродуктов и медикаментов США (от англ.