Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных

На правах рукописиЛЕВШЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНАКАРБОКСИЛСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОСФЕРЫ ДЛЯИЗУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОГО СТРОЕНИЯ СОСУДИСТОГО РУСЛАЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХСпециальности: 02.00.06 − высокомолекулярные соединения03.01.06 – биотехнология (в т.ч. бионанотехнология)АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукМОСКВА 2012Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Московском государственномуниверситете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова накафедре «Химия и технология высокомолекулярных соединений им.

С.С.Медведева» и в ФГБУН Научно-исследовательском институте физикохимической медицины ФМБА России в лаборатории морфологии.Научные руководители:доктор химических наук, профессорзаслуженный деятель науки РФГРИЦКОВА Инесса Александровнадоктор медицинских наук, профессорГУСЕВ Сергей АндреевичОфициальные оппоненты:доктор химических наук, профессорПАПИСОВ Иван Михайловичпрофессор кафедры химииМосковского автомобильно-дорожногогосударственного техническогоуниверситетадоктор химических наук, профессорВАСИЛЕНКО Иван Александровичдиректор испытательной лабораторииООО «ОЛФАРМ»Ведущая организация: Государственный научный центр РФ Федеральноегосударственное унитарное предприятие «Ордена Трудового Красного Знаменинаучно-исследовательский физико-химический институт имени Л.Я.Карпова»(ФГУП «НИФХИ им.Л.Я.Карпова»)Защита состоится «29» ноября 2012 г.

в 1500 на заседании ДиссертационногоСовета Д 212.120.04 в ФГБОУ ВПО Московском государственномуниверситете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова поадресу: 119571, г. Москва,пр. Вернадского, д. 86, корп. Т, ауд. Т-410.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Московскогогосударственного университета тонких химических технологий имени М.В.ЛомоносоваАвтореферат разослан «»2012 года.Ученый секретарьДиссертационного Совета Д 212.120.04Доктор химических наук, профессорГрицкова И.А.2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы.Одной из актуальных проблемных областей применения полимерныхмикросфер в биотехнологии может быть их использование для исследованияваскуляризации тканей (степени развития в них сосудистого русла), чтонеобходимо для понимания патогенеза опухолевого роста.Существующие методы исследования сосудистого русла, основанные назаполнении их смесью тушь-желатин и азотнокислым серебром илибыстрополимеризующимся мономером с последующим изучением препаратовс помощью светового или растрового электронного микроскопа, не позволяютпоследовательно изучать закономерности ветвления сосудов, что необходимодля понимания их функционального состояния.В этом плане могут быть перспективными полимерные микросферы,окрашенные люминесцентным красителем, с использованием флуоресцентнойконфокальной микроскопии для построения трехмерной модели сосудов.Полимерные микросферы должны обладать высокой интенсивностьюфлуоресценции, низкой адгезивной активностью к внутренней поверхностисосуда, что исключит их прилипание к стенкам сосуда, и не образовыватьконьюгатов друг с другом и с биологическими молекулами.Для построения модели сосудистого русла с высоким разрешением(менее 0,1 мкм) и изучения характера контуров просвета необходимо плотноезаполнение сосудов полимерными микросферами.

Размер микросфервыбирают, исходя из среднего размера сосудов экспериментальных животных,который колеблется в интервале 4 – 100 мкм. Минимальный размер частиц длязаполнения всего русла должен быть меньше или соизмерим с длиной волныфиолетовой границы видимого излучения (0,4–0,76мкм или 25000–13158см-1).Цель работы. Синтез карбоксилсодержащих полимерных суспензий с узкимраспределением частиц по размерам, содержащих флуоресцентные метки, длясоздания метода визуализации трехмерного строения сосудистого руслаэкспериментальных животных для изучения ангиогенеза.Научная новизна1. Определены условия синтеза карбоксилсодержащих полимерных микросферразной природы с узким распределением по диаметрам, что позволиловыбрать тип и природу полимерных микросфер, позволяющих плотнозаполнять сосудистое русло экспериментальных животных для изучения егостроения.2.

На основании данных по изучению кинетических закономерностейполимеризации стирола и метилметакрилата и сополимеризации стирола сметакриловой кислотой в присутствии нерастворимых в воде ПАВразработаны рецептуры синтеза полимерных микросфер разного диаметра с3узким распределением по размерам, устойчивых в физиологическихрастворах.3. Впервыедлясинтезакарбоксилсодержащихполистирольныхиполиметилметакрилатных суспензий использовано кремнийорганическоегемини-ПАВ – α, ω–бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан, ипоказано, что оно проявляет высокие поверхностно-активные свойства награнице мономер/вода (σ1,2 = 28,1 мДж/м2) и образует прочные межфазныеслои на поверхности ПМЧ/вода.4. Разработана методика визуализации трехмерного строения сосудистого руслаэкспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченныхполимерных микросфер. Этот метод позволяет избирательно блокироватьзаполнение сосудов заданного внутреннего диаметра и последовательноанализировать их ветвление.5.

Показано, что разработанный метод визуализации трехмерного строениясосудистого русла экспериментальных животных с помощью наборафлуоресцентно меченных полимерных микросфер позволяет получитьинформацию о характере контура просвета сосуда для анализа наличия илиотсутствия препятствий току крови и степени извитости стенки сосуда.6.

Разработанная методика визуализации трехмерного строения сосудистогорусла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентномеченных полимерных микросфер опробована и рекомендована дляиспользования медицинским учреждениям.7. Показаныперспективыиспользованияполистирольныхиполиметилметакрилатных микросфер для создания иммунодиагностическихтест-систем.Практическая значимость работы. Разработанная методика опробована вФГБУН Научно-исследовательский институт физико-химической медициныФМБА России, выдана рекомендация по ее использованию медицинскимучреждениям.Автор защищает: Кинетические закономерности полимеризации стирола и метилметакрилата,а также сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в отсутствиеПАВ и в присутствии нерастворимых в воде ПАВ различной природы. Рецептуры синтеза полимерных микросфер с узким распределением поразмерам и средними диаметрами в интервале 0,37 – 1,6 мкм. Новое карбоксилсодержащее ПАВ с двумя полярными группами (геминиПАВ) α,ω - бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан в качествестабилизатора полимерных суспензий при гетерофазной полимеризациимономеров.4 Методологию, позволяющую с помощью набора флуоресцентно меченныхполимерных микросфер разного размера изучать строение сосудистого руслаэкспериментальных животных. Перспективы использования полистирольных и полиметилметакрилатныхмикросфер для создания иммунодиагностических тест-систем.Личное участие автора являлось основополагающим на всех этапах работы исостояло в постановке цели исследования, разработке экспериментальных итеоретических подходов при выполнении эксперимента и обобщенииполученных результатов.Апробация работы.

Результаты исследований и основные положениядиссертации докладывались и обсуждались на Международной научнопрактической конференции «Достижения супрамолекулярной химии ибиохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008), XVI Международнойконференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва,2009), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010»(Москва, 2010), Научной секции ПАВ Научного совета по коллоидной химии ифизико-химической механике РАН «Поверхностно-активные вещества втехнологических процессах» (Москва, 2011).Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, втом числе 5 статей по теме диссертационной работы, опубликованных вжурналах, рекомендованных ВАК.Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит извведения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждениярезультатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложенына 107 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц, 39 рисунков.Список литературы содержит 98 наименований.Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы исформулирована ее цель.Глава 1. В Литературном обзоре рассмотрены основные области примененияполимерных микросфер в биотехнологии и медицине, обсуждены материалы поспособам синтеза полимерных микросфер, методам окрашивания полимерныхмикросфер флуоресцентными красителями, а также проведен обзор имеющихсяв литературе сведений о существующих способах изучения строения сосудов.Глава 2.

В Экспериментальной части представлен перечень использованныхвеществ и их индивидуальных характеристик, методов синтеза полимерныхмикросфер и исследования их свойств (дилатометрический метод, методсталогометрии, вискозиметрический метод, электронная сканирующаямикроскопия, конфокальная сканирующая микроскопия).5Глава 3. Результаты и их обсуждение3.1. Синтез полистиролметакриловых суспензийНаиболее часто в качестве носителей биолигандов используютполимерные микросферы с карбоксильными группами на поверхности.

Этообъясняется тем, что способы их синтеза относительно просты и хорошоизучены. Их получают сополимеризацией гидрофобных мономеров (чаще всегостирола) с ненасыщенными кислотами - акриловой, метакриловой, итаконовойи т.д. в присутствии или в отсутствие эмульгатора; затравочнойсополимеризацией стирола и ненасыщенных кислот на полистирольныхзатравочных частицах; полимеризацией стирола с поверхностно-активнымисомономерами или инициаторами, содержащими в своей структурекарбоксильные группы; а также полимеризацией стирола в присутствиинерастворимых в воде карбоксилсодержащих ПАВ.

Однако сложность процессасостоит не только в том, что необходимо исключить полимеризацию полярногосомономера в водной фазе (для получения суспензий с узким распределениемчастиц по размерам), но и в концентрировании карбоксильных групп наповерхности частиц.Распределение карбоксильных групп между поверхностью частиц и ихобъемом, обычно наблюдаемое при этом синтезе, является причинойпостоянного изменения их свойств при хранении вследствие лиофилизацииповерхности из-за миграции карбоксилсодержащих фрагментов полимерныхцепей к границе раздела фаз.Все эти процессы являются причиной того, что хорошо изученная иописанная в литературе сополимеризация стирола с метакриловой кислотойпри обычно используемой ее концентрации 5-10% в расчете на стирол непозволяет синтезировать полимерные микросферы с узким РЧД.Было высказано предположение о том, что снижение концентрации МАК вэмульсии и добавление ее не в водную, а в мономерную фазу, позволит свести кминимуму побочные процессы, приводящие к расширению распределениячастиц по размерам, увеличению их числа и снижению устойчивостиреакционной системы.Сополимеризацию стирола с МАК проводили в отсутствие ПАВ приобъемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, температуре 70С,концентрации инициатора персульфата калия (ПК) 1%масс.

в расчете на смесьмономеров. Концентрацию МАК изменяли в интервале от 0,05 до 2%масс. врасчете на стирол.Было показано, что с уменьшением концентрации метакриловой кислотысущественно уменьшается скорость сополимеризации из-за снижения числа частиц,образующихся при полимеризации полярного мономера в водной фазе. Полнаяконверсия мономеров достигается за 7 - 12ч. Средний размер частиц уменьшаетсяот 0,5 до 0,3 мкм с увеличением концентрации МАК от 0,05 до 2%масс.