Диссертация (Разработка метода расчета рабочих процессов и создание пневмовакуумной установки сепарации ДНК), страница 4

Во избежаниеложного результата исследования необходимо устранить следующие причинывозникновения ошибок на этапе пробоподготовки:–монотонность человеческого труда, использование ручных операций наэтапе пробоподготовки;–кросс-контаминация (перекрестное перемешивание) проб;–низкоекачествовыделяемыхДНКвследствиеиспользованиянедостаточно проработанных методик, оборудования.1.2.Обзор методов выделения ДНК.Выделение и очистка НК из комплексных биологических смесей являетсяэтапом, определяющим достоверность последующего анализа генов и ихобразцов экспрессии [4]. Применяемые методы очистки можно описать спомощью нескольких принципов.

Из-за сильно различающихся по составупроб, а также специфических требований по качеству выделяемого материалатребуетсяболееширокаяклассификацияметодов.В зависимости отприменяемого метода имеются значительные различия в экономических21затратах на оборудование и расходный материал, которые при обзоре методовтакже следует учитывать.Наряду с уже существующими методами, которые реализованы ввысокопроизводительном оборудовании, прилагаются значительные усилия,чтобы упростить расщепление, очистку, ферментативные реакции биопроб, иобъединить эти процессы в небольшом устройстве [5].

Для осуществленияотдельных этапов подготовки проб имеются инженерные решения. За рубежомпроводитсяразработкапервыхинтегрированныхсистем,позволяющихпровести выделение пробы и молекулярно-биологический анализ в единомустройстве. Далее рассматриваются существующие методы очистки ДНК,которые нашли применение в автоматизированных и ручных процессахпробоподготовки.Первичным этапом исследования ДНК является отбор пробы [6]. Взятыеобразцы необходимо сохранить для дальнейшего анализа без потери исходногобиологического материала.

Поэтому образцы охлаждают, замораживают взависимости от типа пробы. После доставки образца в лабораторию проводитсяэтап лизиса (разрушения) входящих в его состав клеток, а также их ядер. Лизиспроводится несколькими различными способами: механическое разрушение(измельчение пестиком, ультразвук, гипотонический лизис), химическоеразрушение(лизисспомощьюдетергентов,хаотропныхагентов),ферментативное расщепление белков. Наиболее распространенный методиспользует хаотропные агенты – вещества, нарушающие трехмерную структуруНК и способствующие их денатурации. Среди хаотропных агентов можновыделить: мочевину, тиомочевину, гуанидинхлорид, гуанидинтиоционат,перхлорат лития.

После лизиса проводится удаление клеточной массы спомощью фильтрации или центрифугирования. Далее приступают к основномуэтапу пробоподготовки – очистке раствора, удалению инородных белков,ингибирующихреакциюПЦР.Преаналитическийэтаписследованиянуклеиновых кислот – пробоподготовка – подробно описан в [7]. Существуетнесколько методов выделения высокомолекулярных структур [4-16]:22–органическая экстракция [4,8,13,15];–спиртовое осаждение [4,8,12,13,15];–выделение с помощью гель-фильтрации [5,12,13,14,16];–ионообменная хроматография [5,12,13,14,15,16];–выделение на бумажных фильтрах [12,15,16];–сорбционная (твердофазная) экстракция [4,8,9,10,11,12,14];–экспресс-экстракция на основе температурного лизиса [4,8,12].Органическая экстракция проводится с применением фенола илифенола/хлороформа и изоамилового спирта, которые растворяют и осаждаютбелки-примеси. Выделение с помощью фенола и фенольных смесей относят кклассическим методам депротеинизации водных растворов НК. При этом винтерфазе (осадке) накапливаются денатурированные белки.

С помощьюприменения небуферизированных фенолов остаточные ДНК могут бытьпереведены в органическую фазу и таким образом при очистке отделены отРНК. Нуклеиновые кислоты, находящиеся в водной фазе могут бытьподготовлены затем с помощью бутанола или осадка этанола. Нестабильныйразмер и позиция интерфазы при пробоподготовке, а также возможныйфазовый переход при определенных условиях расщепления до сих порпрепятствуют надежной автоматизированной фенол-хлороформной экстракции.Преимущества фенол-хлороформной органической экстракции: получение ДНКхорошего качества и высокой концентрации; подходит для разных объектов;хорошо работает со старым, разложившимся материалом, костями; выделеннаяДНК очень стабильна и хорошо хранится в замороженном состоянии.Недостатки – высокая токсичность; занимает много времени; не всегда удаляетингибиторы; возможна контаминация (множество смен наконечников ипробирок); трудно автоматизировать.В методе спиртового осаждения добавление спирта приводит кпреципитации ДНК.

РНК и ДНК образуют вместе с моновалентнымикатионами (например, Na+) в спиртовых растворах нерастворимый осадок. Сиспользованием изопропилового спирта, других катионов (NH4+, Li+) или23различных противоионов (например, ацетат, хлорид) свойства осадка смесимогут изменяться в широком диапазоне. Далее раствор центрифугируется, анадсадочная жидкость удаляется. После нескольких промывок в 70%-номспиртовом растворе соли удаляются, осадок высушивается и растворяется вводном буфере. Для лучшего растворения необходимо перемешивание приповышенной температуре.

Здесь необходимо предусмотреть вортекс итермоблок для нагрева с целью ускорения качественной подготовки пробы.Данный метод занимает много времени и трудоёмок, к тому же не обеспечиваетполной очистки раствора от нецелевых белков. Автоматизация спиртовогоосаждения очень трудоемка, так как невероятно сложно полностью удалитьжидкую фракцию, не теряя при этом осадка. В связи с большой изменчивостьюгранул (размер, консистенция, адгезия) этот метод успешно существовал до сихпор только на нескольких автоматизированных платформах.

Основноеприменение данного метода в молекулярно-генетических лабораториях и всудебной медицине, для диагностики инфекционных заболеваний.Водные ДНК-растворы могут быть очищены также с помощью гельфильтрации [4;16] молекулярным ситом (Сефадекс G25/G50, Сефакрил S300,Amersham Pharmacia Biotech и др.) Материал может конфигурироваться любымпо форме свободно движущихся колонок или спиновых колонок. Эффекточистки базируется на различных характеристиках времени движения большейили меньшей молекулы: В то время как маленькие молекулы внедряются впоры слоя колонки и удерживаются там долгое время, большая молекула ДНКбеспрепятственно проходит в объем удаления. Основанные на гель-фильтрацииметоды принципиально пригодны для автоматизации и распараллеливания вбольшоммасштабе,т.к.параметрыметоданекритичныидолжныпрепятствовать только осушению материала колонки.Ионообменная хроматография [4] (Qiagen, Hilden; Nucleobond, MachereyNagel, Düren) базируется на конкурентном взаимодействии очищаемыхзаряженных молекул и ионов применяемого буферного раствора околосоответствующего носителя заряда твердой фазы.

В этом случае находящийся24на носителе обменный материал (например, DEAE, диэтил-аминоэтанол) несетположительные заряды высокой плотности, которые могут вступить вовзаимодействие с отрицательными зарядами фосфатной структурной сетки НК.С помощью рационального выбора данных условий буфера (pH и концентрациясолей) нуклеиновые кислоты селективно связываются на первом этапе (низкаяконцентрация солей), после чего нежелательные примеси промываются и ДНКилиРНКвысвобождаютсяХроматографиясипомощьюконцентрируютсяионногообменанаэтапенарядусосаждения.цезий-хлор-центрифугированием поставляет ДНК высочайшей чистоты. Проведениехроматографии с доступными сегодня одноразовыми колонками происходитбез проблем благодаря очень надежному методу. Однако для заключительногоконцентрированияпробыВыделениесДНКследующиминеобходимаоперацияпомощьюионообменныхпреимуществами:безопасность,спиртовогосмолChelexпростотаиосаждения.отличаетсябыстрота;возможность автоматизации процесса; дешевизна; используется минимумрасходных материалов; исключена контаминация (процесс в одной пробирке);можно использовать для всех типов, кроме кости; пригодность для любойлаборатории.

Недостатки метода: получается очень грубая, неочищенная ДНК;непостоянство степени эффективности экстракции (количество и качествоварьируются от образца к образцу); высокая вероятность ингибированиясамими смолами; потенциальная нестабильность ДНК и ее деградация современем; полученная ДНК одноцепочечная.Выделение ДНК на FTA-бумажных фильтрах очень эффективно и простодля жидких образцов проб. Данный метод заключается в том, что на ячейкицеллюлозного фильтра наносится смесь сильных буферов, которые лизируютобразцыисвязываютденатурируются.ДНКнуклеиновыезащищаютсякислоты,отадействияинородныенуклеаз,абелкитакжеультрафиолетовых лучей.

Пластинки FTA инактивируют микроорганизмы,включая возбудителей, передающихся через кровь. Очень удобен отбор пробыи транспортировка с использованием данного способа. Преимущества метода:25безопасноеобращениесобразцами(защищенностьотвредныхмикроорганизмов); быстрое выделение высококачественного образца ДНК;длительное хранение образцов при комнатной температуре (FTA-картапрепятствует размножению бактерий); пригодность для большинства образцовжидкого вида; возможность автоматизации (ДНК можно амплифицироватьнепосредственно с фильтра).