1631210424-fcd136b4f3723217ae7fe721f8d45b62 (Лекция 15 - Гликозилирование белков)

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены красным жирным шрифтом.Кому недостаточно материала презентации, загляните на стр. учебника Д.Г. Кнорре, Т.С.Годовикова. С.Д. Мызина, О.С. Федорова «Биоорганическая химия». Учебник: Северин«Биохимия».Ребята, сегодня (2 февраля) у нас лекционное занятие будет проходить дистанционно.

С 9февраля лекции буду походить в очной форме в конференц-зале.ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВО-гликозилирование белков. Посттрансляционное присоединение углеводов к боковым радикалам аспарагина, серина, треонина игидроксилизина.Неферментативное гликирование белков.Роль биооргаников в исследовании процессов, связанных с гликозилированием и гликированием белков.Биоортогональные реакции для анализа межмолекулярных взаимодействий in vitro и in vivo. Требования, предъявляемые креакциям, относящимся к «клик»-химии. Азид-алкиновое циклоприсоединение (медь-катализируемый вариант, Cu-catalyzedazide-alkyne cycloaddition «CuAAC» и реакция, промотируемая напряжением, strain-promoted azide-alkyne cycloaddition«SPAAC»).Синтез белков, содержащих биоортогональные функциональные группы.ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ (реакции нуклеофильного замещения)Гликопротеины и протеогликаны.Сахара в живой природе встречаются не только в самостоятельномвиде, но и в виде более сложных конструкций, в частности аддуктов сбелками – гликопротеинов и высокомолекулярных соединений,состоящих из белка с высокой степенью гликозилирования, углеводныеостатки которых представляют собой длинные неразветвленныеполисахаридные цепи.Присоединение олигосахаридов к белкам (гликозилирование) являетсяодним из важнейших видов посттрансляционной модификации белков.Эта модификация обеспечивает локализацию белка внутри клетки.Обычно остатки сахара связаны с амидной группой аспарагина илиОН-группами серина, треонина или гидроксилизина.Многие белки, включая транскрипционные факторы, белки ядерныхпор, онкопротеины, содержат моносахаридный остаток Nацетилглюкозамина, который вводится в белок с помощью O-GlcNAcтрансферазы и отщепляется соответствующей гидролазой.Короткие О-гликозидные цепи в О-гликопротеинах, важные дляпроявления транскрипционной активности, могут служить элементомузнавания при взаимодействии с мембранными клеточнымирецепторами, принимающими участие в проведении сигнала в клетку..Реагенты для присоединения остаткасахара к белкам.

Биохимия (Учебник:Северин «Биохимия». Стр. 703-712).Гликопротеины представляют собой производные белков, вкоторых к определенным остаткам аминокислот присоединеныолигосахариды. Полисахаридные цепи гликозаминогликановсинтезируются путем последовательного присоединениямоносахаридов. Донорами моносахаридов являютсясоответствующие нуклеотид-сахара. Реакции синтезагликозаминогликанов катализирую ферменты семействатрансфераз. Эти трансферазы локализованы на мембранахаппарата Гольджи. Сюда по каналам эндоплазматическогоретикулума поступает коровый белок, синтезированный нарибосомах, к которому присоединяются моносахаридысвязующей области и затем наращивается вся полисахариднаяцепь.Аминосахара синтезируются из глюкозы; в соединительной ткани около 20%глюкозы используется таким образом.

Непосредственным предшественником Nацетилглюкозамина, N-ацетилгалактозамина и сиаловой кислоты являетсяфруктозо-6-фосфат. Источником NH2 -групп в этих сахарах служит глутамин.Аминосахар далее ацетилируется с помощью ацетил-CоA. Активированнымиформами этих аминосахаров служат их UDP-производные.Гликозилирование является многоступенчатым процессом, который начинается на внешнейстороне эндоплазматического ретикулума, продолжается на его внутренней стороне изавершается в аппарате Гольджи.Большинство белков, синтезируемых на мембраносвязанных рибосомах, гликозилируются припереносе в полость эндоплазматического ретикулума. Образование N-гликозидов начинается вэндоплазматическом ретикулуме с катализируемого олигосахарилтрансферазой переноса набелок разветвленного тетрадекасахаридного фрагмента (Glc3Man9(GlcNAc)2), доноромкоторого служит углеводсодержащий долихолпирофосфат, погруженный в полостной слоймембраны.

Гликозидазы «подстригают» олигосахариды, отщепляя избыточные остаткиглюкозы и маннозы.N-гликозилирование белков происходит по карбоксамидному атому азота остатка аспарагина впоследовательности Asn-X-Ser/Thr. Не все последовательности Asn-X-Ser/Thr подходят длягликозилирования. Считается, что гликозилируется остаток аспарагина в трипептиде,входящем в состав β-петли, в которой пептидная связь образована между аминогруппойаспарагина и карбоксильной группой серина или треонина.Огромное многообразие гликопротеинов обеспечивается последующим процессингомсвязанного с белком тетрадекасахаридного остатка, который обусловлен действием рядагликозидаз и гликозилтрансфераз.

Образовавшийся после удаления двух остатков глюкозы(Glc) гликопротеин, содержащий N-связанный додекасахаридный остаток, служит местомопознавания белками-шаперонами: калнексином икалретикулином, помогающимигликопротеину принять правильную пространственную структуру во время его перемещенияот места синтеза на мембрансвязанных рибосомах во внутреннюю часть эндоплазматическогоретикулума. После отщепления третьего остатка глюкозы гликозидазой эндоплазматическогоретикулума шапероны теряют сродство к ундекасахариду и диссоциируют из комплекса сгликопротеином.

UDP-глюкоза:гликопротеин гликозилтрансфераза переносит назад остатокглюкозы на ундекасахарид, что заставляет калнексин и калретикулин вступить в следующийэтап рефолдинга гликопротеина. Таким образом осуществляется контроль за поддержаниемфункционально значимой структурной организации секретируемых гликопротеинов.Если гликопротеин не будет свернут правильным образом в течение нескольких цикловдегликозилирования-регликозилирования, он переносится в цитозоль, где подвергаетсяполиубиквитилированию с помощью Е3-лигазы, являющейся составной частью системыдеградации неправильно свернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме, игидролизуется в протеасомах.ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ(реакции нуклеофильногозамещения)ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ (реакции нуклеофильного замещения)Правильно свернутый Man9(GlcNAc)2N-гликопротеин с помощью маннозидаз эндоплазматическогоретикулума и аппарата Гольджи теряет шесть остатков маннозы с образованием связанного с белкомкорового пентасахарида Man3(GlcNAc)2.

Последний может присоединять с помощью различныхгликозилтрансфераз всевозможные моносахариды, разнообразие которых характерно дляэндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. В результате этого число различныхгликопротеинов измеряется десятками тысяч.Присоединение углеводов к белкам чаще всего имеет информационное значение, нацеливая белкина определенные мишени, в одних случаях предопределяя его секрецию, в других – определяялокализацию белка в клетке или на клеточной мембране. Наличие на конце олигосахарида остаткасиаловой (ацетилнейраминовой) кислоты определяет устойчивость клетки.

Например, уэритроцитов наличие у мембранного белка гликофорина олигосахарида, оканчивающегося остаткомсиаловой кислоты, предохраняет эритроцит от преждевременного разрушения, а удаление этогоостатка специальным ферментом сиалидазой превращает его в «старый», подлежащийуничтожению эритроцит.Посмотрим как наше знание процессов, протекающих в живых организмах,способствует созданию молекулярных инструментов для исследования клеточныхпроцессов, связанных с гликозилированием белков, или для получениялекарственных препаратов на основе гликозилированных белков.Те, кто силен в органической химии, сможет решить проблемуиспользования химических реакций для получения молекулярныхинструментов, предназначенных для исследования клеточных процессов,связанных с гликозилированием белков, или для получения лекарственныхпрепаратов на основе гликозилированных белковРоль биооргаников в исследовании клеточных процессов, связанных с гликозилированием белковБиоорганики знают биохимию и понимают какиемолекулы участвуют в процессах гликозилированиябелков.Биоорганики знают органическую химию, поэтому могутприменить свои знания при синтезе аналогов субстратов дляферментов, принимающих участие в гликозилированиибелков.

Например, оказалось, что азидопроизводное глюкозы(Ac)4GlcNAz может вовлекаться в клеточные процессы, приэтом в белок будет вводится остаток сахара, содержащийазидогруппу. Попробуйте получить азидопроизводноеглюкозы ((Ac)4GlcNAz), исходя из молекулы глюкозы.Возникает вопрос: «С какой целью в гликозилированный белок вводитсяазидогруппа?»Получение гликозилированного белка, содержащего биоортогональную функциональную группу — азидлибо алкин (reporter), обеспечивает возможность селективно пометить белок после введение в клеткуметки (probe), например остатка флуоресцентного красителя, снабжённой комплементарнойфункциональной группой (фосфин, циклооктин либо азид).

На следующем этапе возможно получитьинформацию о природе меченого белка.Использование биоортогональной реакции на практике обычно осуществляют в две стадии. Сначала изучаемоесоединение модифицируют биоортогональной функциональной группой внутри клетки. Затем в системувводят низкомолекулярную метку, содержащую комплементарную функциональную группу, и в результатебиоортогональнй реакции происходит селективная модификация (мечение) данного соединения. В дальнейшемвведенная метка позволяет наблюдать за модифицированным субстратом.Обсудим подробнее возможности биоортогональных реакций.БИООРТОГОНАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ• Несмотря на то, что в области органической химии открыто, изучено и описано множествохимических реакций, практически ни одна из них не может быть проведена в клетке или в организметак, чтобы затронуть лишь интересующее исследователя соединение (белок, ДНК, метаболит и др.).Так происходит потому, что биомолекулы содержат большое количество весьма похожих пореакционной способности функциональных групп (преимущественно нуклеофильных), и реакция, вкоторую вступает изучаемое соединение, неизбежно затронет и другие молекулы, содержащиеподобные функциональные группы.