11893 (Методы культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию), страница 2
Описание файла
Документ из архива "Методы культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из 2 семестр, которые можно найти в файловом архиве . Не смотря на прямую связь этого архива с , его также можно найти и в других разделах. Архив можно найти в разделе "курсовые/домашние работы", в предмете "биология" в общих файлах.
Онлайн просмотр документа "11893"
Текст 2 страницы из документа "11893"
Тенуазоновая кислота (TEA) вызывает некротические повреждения с или без образования желтого ореола на листьях. Она подавляет механизм синтеза белка.
Тентоксин (Tentoxin), который действует как фотофосфориляционный ингибитор через специфическое связывание с АТФ-синтазой хлоропласта, вызывая угнетение гидролиза и синтеза АТФ. Из-за того, что этот токсин затрагивает основные клеточные процессы, он является мощным микотоксином [18].
Специфические токсины
К специфическим токсинам, синтезируемым A. alternata f. sp. lycopersici относится AAL-токсины. Первый из них токсин А [TA] был открыт в 1981 году. AAL-токсины – это аминопентольные сложные эфиры, аналоги сфингозина, предшественника сфинганина, сфингониновые аналоги микотоксинов. Они относятся к семейству моноэстеров [18].
Наличие одной пары близких неэстерифицированных диолов в структуре каждого AAL-токсина подтверждает возможное включение эпоксидной гидролазы (EH) в синтез токсинов. Этот гипотетический механизм подтвержден тем фактом, что один из атомов кислорода в диоле присоединяется путем прямого включения атмосферного кислорода, а другой поступает от воды [12].
Гидролазы катализируют гидролиз эпоксидов или ареновых оксидов до их соответствующих диолов путем присоединения воды. Несколько представителей этого подсемейства ферментов представлено в разнообразии в млекопитающих, растениях, насекомых и микороорганизмах [12].
На основании сходства большинство гидролаз относятся к семейству б/ в гидролаз. Это семейство ферментов гидролизует свои субстраты в два этапа, которые включают формирование и гидролиз ковалентной алкил-ферментной промежуточной, которая сформирована при участии нуклеофильной аспарагиновой кислоты [12].
Этот фермент играет определенную роль в способности мицелия инфицировать растения. Активность гидролаз наблюдается одновременно с продукцией пигментов - вторичных метаболитов в стационарной фазе. Также, установили, что синтез AAL токсина происходит одновременно с повышением активности гидролаз [12].
В противоположность токсинам других разновидностей Alternaria alternata, ААL-токсины не вызывают быстрой потери электролитов чувствительных тканей. Подтверждено, что ААL-токсины действуют на аспартат карбамоил трансферазу (ACTаза), ключевой фермент в биосинтезе пиримидина. ACTаза локализована в хлоропластах. ААL-токсины ингибируют развитие клеток на всех уровнях, как у устойчивых, так и у восприимчивых сортов томата [22].
Более того, ААL-токсины ингибируют керамид синтазу в гепатоцитах крысы, и индуцируют апоптоз в клетках почек обезьян [12].
Мутантные формы A. alternata f. sp. lycopersici, не продуцирующие AAL-токсины утрачивают свою патогенность, тем самым подтверждая необходимость этих токсинов для развития инфекционного процесса. AAL-токсины – ингибиторы биосинтеза сфинголипида (керамида). Применение AAL-токсинов ведет к накоплению сфингоидных предшественников, истощению комплекса сфинголипидов и в конце концов к смерти клеток восприимчивых сортов томатов. AAL-токсины, вызывающие смерть клеток растений томатов по механизму действия сходны с генетически контролируемым клеточным суицидом или апоптозом, что подтверждает участие растения в обусловленной токсином смерти клеток [18].
Лестницы ДНК наблюдаются на протяжении смерти клеток в содержащих токсин протопластах и листьях томата. Интенсивность ДНК лестниц увеличивается под действием Са 2+ и угнетается под действием Zn 2+. Интенсивное разделение фрагментированной ДНК на отдельные фрагменты совпадало с появлением лестниц ДНК, что также наблюдается на протяжении смерти протопластов томата. Процесс апоптоза происходит одновременно с процессами развития в растении, и является функциональным процессом, в результате которого формируются симптоматические повреждения на растениях томата [20].
AAL токсины разделяют на 5 групп ТА, ТВ, ТС, TD, TE. ТА и ТВ – наиболее активные изоформы, состоящие из близко связанных компонентов. ТА и ТВ – аминопентолы, средний молекулярный вес 528 Da, они имеют одинаковую специфическую активность.
Токсин ТА индуцирует стререотипические признаки апоптоза, включающее формирование лестниц ДНК, уплотнение ядер ДНК и последующее появление апоптозных телец. Он не угнетает прогресс клеточного цикла [21].
Эта молекула представляет собой новый класс природных токсинов, которые могут быть использованы как модельные компоненты для дальнейшей характеристики молекулярных и бимолекулярных путей, ведущих к апоптозу.
Существует доказательство, что этот микотоксин ведет к разрушению сфинголипидного метаболизма. Важный участок ингибирования – это реакция, катализируемая сфингозин N-ацетилтрансферазой (керамид синтаза).
Cфинголипиды играют важную роль в росте и дифференцировке клеток. Они также могут влиять на пролиферативный потенциал клеток путем индукции или супрессии апоптоза. Полагаясь на факт, что AAL-токсины напоминают сфингоидные основания, сфинголипиды могут вызвать смерть клеток, путем индуцирования апоптоза и/или путем изменения клеточного цикла [21].
Токсичность AAL токсинов изучают на разных тканях томатов, включая листья на разных стадиях развития. Чувствительность наблюдается на всех уровнях, наиболее чувствительны молодые листья [11].
В растениях нечувствительность к AAL-токсинам и устойчивость к AAL-продуцирующей A. alternata f.sp. lycopersici определяется ко-доминирущим Alternaria stem cancer (Asc-1) геном, гомологом гена дрожжей. Хотя, точный способ действия Asc-1 не был определен, базируясь на изучении гомологов у дрожжей, считается, что Asc-1 уменьшает токсин-индуцированное блокирование сфинголипидного синтеза через «спасение» ER-to-Golgi транспорта GPI – заякоренных белков [18].
Аsc locus - ген с двумя аллелями, когда наблюдается полная доминантность – растения устойчивы к патогену, когда неполная доминантность – восприимчивы к токсину [4].
Гомозигота восприимчивых линий в 1000 раз более чувствительна к ААL-токсинам, чем устойчивые линии, в то время как их гибрид F1 имеет промежуточную чувствительность, являясь в 50 раз более чувствительным, чем гомозигота устойчивых образцов [22].
Эти данные подтверждают, если аsc locus контролирует обе функции. К тому же аsc locus удобен для физиологических исследований функционального генного контролирования взаимодействия патоген – хозяин, используя AAL-токсин как молекулярный маркер, если обе реакции контролируются одинаковым локусом. Совместимые или несовместимые взаимоотношения патоген – хозяин часто обусловлены различием только одного гена. Однако различия в физиологическом состоянии устойчивых и восприимчивых инфицированных растений-хозяев часто обусловлено поддельными биохимическими событиями, которые являются следствием аллельного различия между близко связанными, но не относящимися к болезни локусами [4].
1.3 Системная приобретенная устойчивость
Растения развивают большое количество индуцированных защитных механизмов против патогенов. Распознание патогена вызывает локализованную реакцию сопротивления, известную как сверхчувствительный ответ (HR), который характеризуется быстрой смертью клеток в месте инфекции. В 1960 Росс показал, что растения табака, зараженные вирусом табачной мозаики, впоследствии развивали возрастающую устойчивость к вторичным инфекциям в тканях. Такое распространение устойчивости в пределах тканей растений было названо системная приобретенная устойчивость (SAR) [6].
SAR может быть активирована в любом растении патогенном, который вызывает некроз или как часть HR. Такая устойчивость длительна, и иногда может сохраняться на протяжении всей жизни растения. Молекулярно SAR характеризуется возрастающей экспрессией большого числа связанных с патогенезом генов (PR-гены). PR-белки были впервые описаны в 1970 г. Ван Лунном, который обнаружил накопление различных новых белков после инфицирования табака вирусом TMV [6].
В 1979 г. Уайт обнаружил, что накопление PR белков и устойчивость к TMV можно индуцировать путем обработки растений табака салициловой кислотой (SA), аспирином (ацетил SA), или бензойной кислотой. Доказательства, что SA – это сигнал для индукции SAR поступили также из двух публикаций 1990г. Малами показал, что концентрация эндогенной SA возрастает в тканях растений после инфицирования табака вирусом TMV, и этот рост кореллирует с индукцией PR генов [6].
Необходимость SA в качестве эндогенного сигнала для SAR было показано Гаффнеем, он использовал бактериальный ген nahG, кодирующий салицилат гидроксилазу, которая удаляет SA путем превращения ее в катехоламин. Трансгенный табак, экспрессирующий ген nahG накапливал очень мало SA после атаки патогена и не экспрессировал PR белки. [5, 6]
Растения, которые не реагируют на SA были выделены в мутантные линии, также они несут мутации по одинаковым генам NPR1/NIM1 (NON-EXPRESSER OF PR GENES1/NONINDUCIBLE IMMUNITY1) [6].
1.3.1 Природа системного сигнала
Салициловая кислота
Салициловая кислота – фенольное соединение, важный молекулярный эффектор. Она регулирует ряд важных процессов: термогенез, защитные ответы на атаки патогенов, синтез этилена и созревание плодов. Также существуют данные, что SA участвует в регулировании ответов растений на абиотические стрессы, в частности УФ излучение и озон [15].
SA – системный сигнал для SAR. Исследования показали, что большинство накапливающейся SA (69%) было синтезировано и экспортировано из инокулированных листьев. В других исследованиях было показано, что SA была найдена и в инфицированных листьях и синтезирована de novo [6].
Последние данные подтверждают, что сигнализирование может происходить и за счет преобразования SA в летучее соединение метиловый салицилат, который может вызвать устойчивость не только в незараженных частях этого самого растения, но также и у соседних растений [6].
Синтез SA
SA может быть синтезирована в растениях путем превращения фенилаланина в транс-коричную кислоту, которая синтезирована ферментом фенилаланин аммиак-лиазой (phenylalanine ammonia-lyase или PAL). Фермент PAL является светоиндуцируемым. Поэтому в темноте накопление SA происходит медленно, а защитные реакции протекают с низкой интенсивностью. Недавно было показано, что SA может также синтезироваться из бензойной кислоты (ВА), которая может быть гидраксилированна в SA [1].
Также было показано, что как и у бактерий SA может синтезироваться из хоризмата через изохоризмат. Экспрессия бактериальных ферментов, катализирующих эти реакции изохоризмат синтаза 1 (ICS1) и изохоризмат пируват лиаза 1 (IPL1), в табаке и Arabidopsis привело к повышенному накоплению SA и устойчивости к патогену. Изохоризматный путь синтеза в растениях – главный источник синтеза SA.
SA можно обнаружить в двух формах в растении: (i) свободная SA, которая возможно имеет сигнальную функцию и (ii) главная запасающаяся форма Я-O-D-глюкосалициловая кислота (SAG) [5]. Этот гликозид ассоциирован с клеточной стенкой и расщепляется специфической в-гликозидазой. При действии стрессов нетравматического типа происходит высвобождение в-гликозидаз клеточной стенки. Затем происходит расщепление гликозида и высвобождению свободной SA. Таким образом, превращение SAG в свободную и активную SA может значительно повлиять на сигнальную передачу SA [1].
Транспорт системного сигнала
SA была обнаружена во флоэме нескольких видов растений, это позволило предположить, что именно это вещество является флоэмно-транслоцируемым сигналом. Эксперименты подтвердили, что сигнал SAR инициируется в инокулированных листьях, и транспортируется по проводящей системе (флоэма) к верхним листьям [1, 6].
Активные формы кислорода (ROS)
Существует несколько салицилат-связывающих белков. Главными мишенями для внеклеточной SA являются внеклеточные каталазы и пероксидазы. Присоединяясь к молекулам этих ферментов, SA изменяет их каталитическую активность и запускает окислительную вспышку – резкое усиление синтеза активных форм кислорода. Салициловая кислота является ключевой молекулой, запускающей в растительном организме этот процесс [1].
Во внеклеточном пространстве накапливается перекись водорода: HO2∙ + O2∙ ─ + Н+ ↔ Н2О2 + О2 либо 2O2∙ ─ + 2Н+ ↔ Н2О2 + О2, это приводит к накоплению других активных форм кислорода – супероксидного аниона (O2∙ ─), гидроксильного радикала, синглетного кислорода и др. Во внеклеточном пространстве растения происходит окислительная вспышка, она разрушительно воздействует на патогенные микроорганизмы.
Поскольку H2О2 не имеет неспаренного электрона, она может пересекать биологические мембраны. Протонирование O2∙ ─, которое происходит более легко при низком рН, дает гидропероксильный радикал HO2, он может пересекать биологические мембраны примерно так же эффективно, как и H2О2. HO2∙ может непосредственно атаковать жирные кислоты, и, как показано, превращает линоленовую, линолевую и арахидоновую кислоты в перекиси липидов.
Также перекись водорода является главным вторичным мессенжером сигнала индуцирования устойчивости. SA запускает экспрессию PR-генов благодаря ей. Перекись водорода способна индуцировать активность ряда важных ферментов, таких как NADH-дегидрогеназ (NADH-DH) хлоропластов, что также играет определенную роль в генерировании SAR.
Второй группой салицилат-связывающих белков являются пероксидазы - регуляторные ферменты. Кислые пероксидазы клеточных стенок способны связывать SA, фермент начинает генерировать перекись водорода с использованием NADPH.