10504 (Репликация различных ДНК, ее регуляция и репарация), страница 2

В некоторых кольцевых геномах в каждой цепи имеется своя точка начала репликации (например, в митохондриальной ДНК животных ). Синтез одной цепи начинается в точке ori_R. Когда новая цепь доходит до точки ori_D, начинается синтез другой цепи. Синтез инициируется путем образования праймерной РНК.

Некоторые двуцепочечные кольцевые хромосомы реплицируются альтернативным способом, называемым репликацией по типу катящегося кольца. В этом случае двуцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца), и к образовавшемуся в результате надреза 3΄ - гидроксильному кольцу с помощью полимеразы III присоединяются нуклеотиды; при этом матрицей служит интактная замкнутая цепь. Таким образом в вилке синтезируется только лидирующая нить. По мере синтезалидирующей цепи происходит вытеснение 5΄-конца надрезанного кольца как одиночной цепи. В результате длина лидирующей цепи может превышать длину матрицы в 2-5 раз. Такой способ репликации используют фаги М13 или фX174 (их зрелые геномы одноцепочечные кольцевые ДНК)на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как инфицирующая ДНК превращается в двуцепочечную кольцевую форму. Постоянно отделяющиеся одиночные цепи ДНК, образуемые при репликации по типу катящегося кольца, надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых форм, упаковываемых в вирусные частицы. Фаг λ использует такой способ репликации при образовании двуцепочечной линейной вирусной ДНК. Субстратной матрицей в этом случае является двуцепочечная кольцевая ДНК, которая была реплицирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму.

Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: α, β, γ, δ, и ε. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза δ. ДНК-полимераза α отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза β — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза γ ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы ε пока неизвестна.

Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек. Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы δ служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких независимо инициированных новосинтезированных цепей.

Теломеры и центромеры. Центомеры и теломеры – наиболее четко выраженные морфологические структуры хромосом (прозрачка 12). Долгое время считалось, что их строение и функции связаны с какими-то особенными последовательностями ДНК. Однако удалось выявить лишь одну такую особенность на молекулярном уровне: присутствие в области центромер и теломер сателлитной ДНК. Сателлитная ДНК – это длинные тандемные повторы, расположенные в области центромер и теломер.

Строение центромер. У млекопитающих центромеры имеют сложную дискообразную структуру, называемую кинетохором. С каждой стороны хромосомы располагается по одному кинетохорному диску. Во время митоза микротрубочки фибрилл веретена деления прикрепляются непосредственно к плотному наружнему слою кинетохора, связанному с петлями хроматина. Кинетохор у дрожжей образуют CEN-области (короткие сегменты ДНК) вместе с ДНК-связывающими белками (прозрачка 13). Последовательности, расположенные с одной или с обеих сторон от CEN-областей, могут блокировать прохождение репликационной вилки до появления специфического сигнала, разрешающего окончание репликации в анафазе.в таком случае число хромосом не будет превышать одной на дочернюю клетку.

Последовательности в области теломер. Теломеры –концы эукариотической хромосомы, являются также и концами линейного дуплекса ДНК. Именно с теломерами связана одна из проблем репликации: как достраиваются 5΄-концы хромосомного дуплекса, если ДНК-полимеразы не инициируют синтез новых цепей? Возможно, этот вопрос решается также как при репликации линейного дуплекса аденовирусов, или с помощью альтернативных механизмов? Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом – теломеры – реплицируются с помощью особого механизма. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3΄- и 5΄-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Недавно из Tetrahymena был выделен фермент – теломераза – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, которая присоединяет повтор 5΄-TTGGGG-3΄, последовательно по одному нуклеотиду, к 3΄-концам специфических олигонуклеотидных праймеров (TTGGGG)_n (Tetrahymena) и (TGTGTGGG)_n (дрожжи). Таким образом, теломераза может строить теломеры при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы (ппрозрачка 20). Теломераза – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс, а для проявления ферментативной активности требуется как РНК так и белки. Гипотетически схема образования теломеры представлена на рисунке. В верхней части рисунка представлено образование петли на конце цепи, содержащей последовательность 5΄-(TTGGGG)_n-3΄, и одноцепочечных разрывов на противоположной цепи, содержащей последовательность 5΄-(CCCCAA)_n-3΄. К 3΄-концу нижней цепи с помощью телоизомеразы присоединяются последовательно, по одному нуклеотиду, единицы 5΄- TTGGGG -3΄. Праймаза и ДНК-полимераза копируют 5΄- (TTGGGG)_n -3΄-цепь с образование новых 5΄-(CCCCAA)_n-3΄-единиц. В результате неполного лигирования в С-богатой цепи остаются одноцепочечные разрывы. На 3΄-конце 5΄-(TTGGGG)_n-3΄-цепи вновь образуется петля, стабилизируемая взаимодействиями между остатками гуанозина.

Терминация репликации.

Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает процесс завершения репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепи вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3΄-гидрокси- и 5΄-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо – при двунаправленной репликации – в середине кольца (прозрачка 14). Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом они обычно оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II (прозрачка 15).

Терминация и расхождение в линейных ДНК. За исключением аденовирусной ДНК, где синтезновых цепей ДНК инициируется белковым праймером и матричная цепь копируется полностью (прозрачка 16), во всех других случаях для репликации необходим РНК-праймер, что создает особые проблемы при завершении репликации линейной дуплексной ДНК (прозрачка 17). Дело в том, что после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5΄-конце. Поскольку никаких способов удлинения 5΄-концов цепей ДНК ене существует, необходимы какие-то иные методы завершения репликации. Были предложены два способа.

Первый: предполагает, что существуют цепи ДНК с прямыми повторами на концах (прозрачка 18). После репликации два комплиментарных конца обоих незавершенных дуплексов могут спарится и образовать линейные конкатемеры с одноцепочечными разрывами.остающиеся пробелы могут быть заполнены путем удлинения цепей в направлении 3΄ →5΄ с последующим соединением их ДНК-лигазой либо путем прямого соединения стыкующихся концов с помощью ДНК-лигазы с образование конкатемеров. После надрезания конкатемера специфической эндонуклеазой образуются выступающие 5΄-концы, и ДНК-полимераза может наращивать более короткие цепи с 3΄-конца.

Второй. Предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК коротких инвертированных повторов, благодаря которым образуются небольшие петли (прозрачка 19). 3΄-конец петли служит праймером для копирования нереплицированного участка. Благодаря специфическому разрыву в начале инвертированного повтора получается структура, которую можно достроить с 3΄-конца до восстановления исходной двуцепочечной концевой последовательности.

Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований.

Репарация ДНК

ДНК – это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять (репарировать) повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплиментарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации (см. ниже). Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двуцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.

Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N (депуринизация) при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации -–это ведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки Ц и А могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образование соответственно остатков У и гипоксантина; частота таких событий примерно 100 на геном – это ведет к появлению мутаций.

Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. Это алкилирующие агенты (азотистые соединения, алкилсульфонаты, нитрозомочевина), которые модифицируют предпочтительно Г-остатки, соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительны физические воздействия – поглощение Т или Ц УФ-света приводит к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; ионизирующая радиация (космические лучи) способствует образованию высокореакционоспособных свободных радикалов, оказывающих на ДНКсамые разнообразные воздействия; рентгеновские лучи – вызывают в ДНК одно-и-двуцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия свободных радикалов.

Известны два основных способа репарационных процессов:

непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;

удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ресинтез этого участка путем репликации.

репарация путем прямого восстановления исходной структуры.

Если под воздействием алкилирующих агентов – N-метил –N-нитрозомочевины или N¹, N-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образовался О⁶- метил- или О⁶-алкилзамещенные гуаниновые остатки, то деалкилирование таких остатков идет при участии ферментов – О⁶-метилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, которая катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Это у бактерий и млекопитающих.

Если при облучении ДНК УФ-светом образовались циклобутановые димеры между соседними парами пиримидиновых оснований, то осуществляется ферментативное (фотолиазы –нет у млекопитающих) превращение их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и используя энергию поглощенног им света разрушает димер без разрыва цепей ДНК.

Репарация путем замены модифицированных остатков.

Замена модифицированного нуклеотида обычно проходит в четыре этапа:

1 этап. Фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Выщепление сайтов, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация осуществляется ферментами АР (апуриновые, апиримидиновые)-эндонуклеазы. В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют ферменты – N-гликозилазы, расщепляющие гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоскирибозой (прозрачка 25)

2 этап. Экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь.

3 этап. Удаленный участок синтезируется заново с 3΄-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи.

4 этап. Концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи (прозрачка 26)