90192 (Являются ли вирусы живыми организмами), страница 10

Вирусная генетическая информация в трансформированных клетках.

Все трансформированные вирусом клетки содержат его генетический материал. За исключением ДНК вируса ЭБ, который поддерживается в трансформированных им лимфоцитах в виде плазмиды, вирусная ДНК ковалентно интегрирована с ДНК клетки - хозяина. Что касается ретровирусов, то интеграция провируса с геномом клетки вообще является естественной стадией их репродуктивного цикла. В отношении ДНК опухолевых вирусов, напротив, нет данных об обязательном участии интеграции в их литическом цикле, хотя при продуктивной инфекции в таких зараженных клетках обнаружены нуклеотидные последовательности, состоящие из фрагментов вирусной и клеточной ДНК.

Наиболее убедительные доказательства линейной интеграции вирусной и клеточной ДНК представили Ботган и др. Эти исследователи расщепляли рестрикционными пидонуклеазами ДНК клеток, трансформированных вирусом SV 40, и получали фрагменты, которые содержали среди клеточных нуклеотидных последовательностей полные интегрированные с ними геномы вируса. Эти авторы установили также последовательность расположения в геноме вируса выделенных фрагментов ДНК. В результате было обнаружено, что в каждой из исследованных клеточных линий кольцевая ДНК вируса расщеплялась в разных точках и встраивалась в разные области клеточной ДНК. Таким образом, в отличие от строго локализованной интеграции генома фага Л с бактериальным геномоминтеграция генома SV 40 с геномом клетки - хозяина скорее всего представляет собой процесс неспецифический. в большинстве случаев в трансформированных клетках обнаруживаются лишь фрагменты вирусной ДНК.

В клетках, трансформированных ДНК вирусами, содержится вирус специфическая РНК. Используя сыворотки животных с опухолями, индуцированными соответствующими вирусами, методом флуоресцирующих антител установили, что в трансформированных клетках содержатся вирусные антигены. Так, в клетках, трансформированных паповавирусами, всегда содержится Т-антиген-белок, синтезируемый на ранней стадии литического цикла вируса. Следовательно, в трансформированных вирусами клетках содержатся вирусные ДНК, РНК и белки ; это наводит на мысль, что за трансформированное состояние ответственны молекулы, кодируемые геномом вируса.

Роль трансформации при литической инфекции.

Согласно общепринятым взглядам, способность вируса вызывать заболевание - это всего лишь побочный эффект работы механизмов, лежащих в основе размножения вируса. Для самого вируса нет очевидной “необходимости” в том, чтобы вызывать симптомы того или иного специфического заболевания у организма - хозяина. Быть может, в основе развития у вирусов способности вызывать опухоли лежит тот факт, что в делящихся клетках вирусы размножаются лучше, чем в неделящихся. По-видимому, именно на этой основе развилась характерная для онкогенных вирусов способность побуждать клетки к росту и делению. По крайней мере в отношении паповавирусов и аденовирусов такое объяснение звучит весьма убедительно : эти вирусы, проникая в клетки, вскоре индуцируют синтез ДНК, ибо синтез ДНК является одной из стадий их литического цикла. Вероятно, гены вируса, продукты которых ответственны за индукцию синтеза ДНК, - это те же самые гены, которые ответственны за трансформацию клетки. Таким образом, онкогенные свойства этих вирусов могут быть прямым следствием работы механизма их репликации. Поскольку ДНК - содержащие вирусы трансформируют клетки только при тех условиях, при которых сами размножаться не могут, их способность превращать нормальные клетки в трансформированные, т.е. в клетки способные к беспрерывному делению, может и не играть роли в их собственном размножении. Более того, вариабельность точек интеграции вирусной и клеточной ДНК наводит на мысль, что интеграция их геномов развилась в процессе эволюции случайно, а не как необходимая стадия. И действительно, в естественных условиях не описано случаев злокачественной опухоли, вызываемой паповирусами, хотя доброкачественные опухоли, например бородавки у человека и папилломы у кроликов, эти вирусы вызывают.

Индукция опухолей.

Реализация способности вируса вызывать образование опухолей зависит от многих факторов. Одним из критических факторов могут быть свойства самого вируса : например, избирательной способностью вызывать опухоли молочных желез обладает лишь один класс ретровирусов. Определяющим фактором могут быть и свойства клеток - мишеней, например наличие на их поверхности соответствующих неблокированных рецепторов или присутствие внутриклеточных ограничивающих факторов. Конечный результат может определяться и свойствами тканей, не содержащих клеток - мишеней для данного вируса. В качестве примера можно указать на способность организма - хозяина к иммунной реакции на данный вирус или зараженные им клетки. Чтобы заражение организма вирусом привело к возникновению опухоли, все факторы, имеющие отношение к этому процессу, в том числе физиологические и генетические, способные блокировать индукцию опухоли или ее развитие, должны быть представлены в пермиссивном варианте. Первым условием реализации вирусного онкогена является наличие в организме хозяина чувствительных к данному вирусу клеток. Когда речь идет о вирусах с узким кругом чувствительных клеток - мишеней (к числу таких относится, например, вирус лейкоза Френд, который специфически поражает только незрелые клетки мышей), следует иметь в виду, что наличие в организме чувствительных клеток может зависеть и от возраста или физиологического состояния.

Возможен и вариант, при котором в организме животного имеются клетки-мишени, однако рецепторы вирусов блокированы. Ситуация такого рода возникает, например, когда рецепторы, предназначенные для связывания с данным вирусом, блокированы вирусными глико-протеидами родственного ему эндогенного ретровируса, находящегося в клетке - мишени. Онкоген под влиянием унаследованного вируса не является простым результатом индукции латентного генома клетки - мишени. Более вероятно, что для этого соответствующий вирус должен попасть в клетку - мишень, распространяясь по организму из какого-то исходного пункта, где происходит индукция. Прямым свидетельством экзогенной инфекции клеток при наследственном лейкозе является факт увеличенного числа вирусных генов в опухолевых тканях. Иммунная система организма реагирует на опухолевые клетки лишь в том случае, если они имеют новые поверхностные антигены. Если животное предварительно иммунизировать клетками опухоли, индуцированной паповирусом, то другая опухоль, индуцированная тем же вирусом, у него при имплантации отторгается - свидетельство того, что данные вирусы вызывают на поверхности трансформированных ими клеток образование специфического опухолевого трансплантационного антигена. Этот антиген является вирус - специфическим. Так, вирус полиомы и SV 40 индуцируют различные трансплантационные антигены.

Вирусы и злокачественные опухоли у человека.

Одним из аргументов против роли вирусов в возникновении большинства злокачественных опухолей у человека считается тот факт, что в подавляющем большинстве случаев злокачественные опухоли не заразны, тогда как при вирусной этиологии можно ожидать передачи от человека к человеку. Если, однако, допустим, что в возникновении опухолей играет роль активация наследуемых вирусов экзогенными факторами, то следует ожидать, что будут выявлены факты наследственного предрасположения к злокачественным опухолям. Такое предрасположение к развитию некоторых опухолей действительно обнаружено, но этому можно найти различные объяснения. Несмотря на 10 лет интенсивной работы, направляемой специальными правительственными программами, связь между злокачественными опухолями у человека и вирусами все еще остается проблематичной. Представляется в высшей степени странным, что онкогенные вирусы, которые играют столь очевидную роль в возникновении опухолей у самых разных животных, должны почему-то “обходить” человек.

Взаимодействие между вирусами растений и их хозяевами. Экспериментальные системы.

До недавнего времени большая часть исследований, касающихся размножения вирусов растений и других аспектов взаимодействия этих вирусов с их хозяевами, проводилась с применением различных комбинаций косвенных методов, ибо отсутствовали культуры клеток растений, необходимые для количественного изучения вирусной инфекции в системе in vitro. Однако за прошедшие десять лет в этом отношении удалось добиться существенных успехов. Во-первых, был разработан метод получения протопластов клеток растений, причем оказалось, что эти культивируемые in vitro структуры можно заражать вирусами. Во-вторых, было установлено, что из организмов насекомых - переносчиков вирусов, вызывающих заболевания растений, - можно получать однослойные культуры клеток, чувствительных к соответствующим вирусам. Оба этих подхода открывают широкие возможности разработки точных методов титрования вирусов растений и изучения их биосинтеза. Уже сейчас стало ясно, что у вирусов растений общая стратегия их взаимодействия с хозяевами, реализующаяся на уровне одной клетки, та же, что и у сходных с ними вирусов животных. Протопласты, выделенные из мезофильных клеток табака, можно заразить ВТМ и таким образом, изучить одиночный цикл размножения этого вируса. Установлено, что после проникновения вирионов в клетку происходит быстрое освобождение их РНК от белковой оболочки (декапсидирование), вследствие чего инфекционность экстрактов клеток, находящихся на стадии эклипса, снижается. Декапсидирование ВТМ осуществляется путем удаления из специального капсида составляющих его субъединиц. Напротив, у ВЖМТ, имеющего икосаэдрическую форму, РНК освобождается из вириона, по-видимому, без разрушения его белковой оболочки. Освобожденная РНК превращается в репликативную и промежуточную репликативную формы с помощью механизмов, вероятно сходных с теми, которые существуют у РНК - содержащих фагов и пикорнавирусов. Вначале общее содержание вирусной РНК возрастает экспоненциально, но на более поздней стадии, когда происходит образование главным образом плюс - цепей РНК, скорость синтеза становится линейкой. Созревание вируса начинается через 4-5 ч. после заражения. Молекулы вирусной РНК, синтезирующиеся на данной и последующих стадиях инфекции, быстро заключаются в капсиды. Однако из клеток выделяется лишь очень небольшое число варионов. Для большинства заболеваний, вызываемых вирусами растений, характерно, что зараженные клетки продолжают продуцировать вирус, не подвергаясь лизису и оставаясь жизнеспособными. Благодаря этому в клетках растений, зараженных такими вирусами, как ВТМ, концентрация вируса может достигать огромных значений. Инфекция передается от клетки к клетке главным образом путем прямого переноса вирионов по межклеточным мостикам (плазмодесмам).

Количественное изучение циклов репродукции вирусов растений можно проводить на вирусах, размножающихся в однослойных культурах клеток насекомых. Так, например, для ВЖКК, относящегося к группе рабдовирусов, была получена кривая его размножения в культуре клеток цикадки, из которой видно, что стадия эклипса продолжается 9 ч., а период размножения 20 ч. ; при этом выход вируса превышает 10 000 вирионов на клетку. Провести такой точный анализ этой кривой оказалось возможным, потому что, как было установлено при помощи метода флуоресцирующих антител, данным вирусом удается синхронно заразить все 100 % клеток культуры, а новосинтезированный вирус можно эффективно оттитровать, используя для этого однослойные культуры клеток насекомых. При заражении интактных растений первый цикл репродукции вируса трудно исследовать из-за того, что вначале вирус заражает лишь очень небольшое число клеток растений, а на более поздних стадиях инфекции, когда количество вируса или вирусных продуктов становится достаточным для проведения точного анализа, циклы репродукции вируса начинают перекрывать друг друга. Если ВЖКК накапливается в культивируемых клетках насекомых в очень больших количествах, то он вызывает слияние этих клеток с помощью механизма, который, вероятно, сходен с механизмом слияния клеток под воздействием паралинсовирусов.

Репликация РНК вирусов растений, по-видимому, катализируется специфическими РНК - репликазами. Из листьев, зараженных ВТМ, были выделены две формы РНК - репликазы. Одна из них - нерастворимая форма, связанная с РНК ВТМ и способная катализировать синтез специфической РНК с использованием рибонуклеозидтрифосфатов. Вторая - растворимая форма с молекулярным весом около 150 000, способная использовать в качестве матрицы для неспецифического синтеза РНК любую из нескольких исследованных в этом отношении РНК. Связанная форма репликазы, которую можно экстрагировать из клеток на поздних стадиях вирусной инфекции, катализирует главным образом синтез плюс - цепей вирусной РНК.

РНК ВТМ представляет собой одиночную цепь с молекулярным весом 2,3 10 , способную кодировать полипептид с молекулярным весом около 2,4 х 10 . В системе in vivo эта РНК кодирует синтез нескольких белков, в том числе белка оболочки (молекулярный вес 17 500) и двух больших полипептидов (молекулярный вес 160 000 и 140 000). Совершенно очевидно, что генетической информации, содержащейся в плюс - цепи РНК ВТМ, было бы недостаточно для кодирования всех этих белков, если бы они синтезировались независимо друг от друга. Следовательно, либо нуклеотидные последовательности, кодирующие синтез этих белков, перекрывают друг друга, либо сначала синтезируется длинный полипептид, который затем расщепляется на более мелкие полипептиды, либо какой-то из этих полипептидов синтезируется на минус - цепи РНК.

Цитологические данные, полученные при изучении вирусных инфекций.

В течение долгого времени считали, что репликация ВТМ происходит только в цитоплазме. Однако некоторые данные, полученные при цитологических и цитохимических исследованиях, позволяют предполагать, что первичным местом репликации РНК этого вируса является, вероятно ядро. Эксперименты с использованием конъюгированных с ферритином акти - ВТМ - антител показывают, что белок ВТМ появляется в клетках листьев через несколько дней после их заражения и сначала обслуживается в цитоплазме главным образом вокруг ядерной мембраны. Белок ВТМ выявляется также и в ядре клетки, однако, судя по результатам электронной микроскопии, завершенные вирионы содержаться только в цитоплазме, но не в ядре. Напротив, вирионы некоторых других вирусов растений, например вируса штриховатости ячменя, обнаруживаются в нуклеоплазме. На срезах клеток, зараженных вирусом желтой карликовости картофеля, для которого характерно наличие внешней оболочки и который морфологически весьма напоминает рабдовирусы, видно, что вирионы этого вируса тесно ассоциированы с ядерной оболочкой. Возможно, что ядерная оболочка служит источником некоторых компонентов входящих в состав внешней оболочки этого вируса. В ядре вирионы этого вируса не обнаруживаются.